蛋白質具有許多優良的特性，在國內外不少檢測標準中[1–2]被選定為評價超濾膜截留性能的標準物質，因而被生產商廣泛用于超濾膜生產過程的質量控制。大部分高純度蛋白價格比較昂貴，實際檢測工作中多使用價格較為低廉的牛血清白蛋白作為標準物質對超濾膜截留性能進行評價。而無論是市售蛋白還是實驗室自行分離純化獲得的蛋白，其相對分子質量及其分布均存在一定差異，這會在一定程度上影響超濾膜截留性能的檢測結果和評價結論。

　　測定聚合物的相對分子質量、相對分子質量分布通常采用高效凝膠排阻色譜法進行。標準樣品應該選擇窄相對分子質量分布的物質，且當2×103Da

　　1實驗部分

　　1.1主要儀器與試劑

　　高效液相色譜儀：Agilent1260Infinity型，美國安捷倫公司;移液器：100～1000μL，德國Eppendorf公司;電子天平：CP225D型，德國Sartorius公司;pH計：ORION3STAR型，美國Thermo公司;超純水機：UPH–I–40型，成都超純科技有限公司;樣品管：5mL;過濾頭：0.45μm孔徑醋酸纖維素膜;

　　醫用注射器：2mL;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：均為色譜純，美國Sigma公司;

　　氯化鈉：色譜純，天津市光復精細化工研究所;高效凝膠排阻色譜柱：TSKgelG3000SWXL型(300mm×7.8mm)，日本東曹公司;混合色譜標準品：含甲狀球蛋白、γ球蛋白、雞卵清白蛋白、馬心肌紅蛋白、維生素B12，美國Biorad公司;牛血清白蛋白相對分子質量標準物質、細胞色素C相對分子質量標準物質中國計量科學研究院;β乳球蛋白：美國Sigma公司。

　　1.2標準物質溶液和樣品溶液的配制

　　將一瓶混合色譜標準品(以下簡稱Biorad混標)溶解于10mL流動相中，其中甲狀球蛋白、γ球蛋白、雞卵清白蛋白各含5mg，馬心肌紅蛋白含量約為2.5mg，維生素B12約為0.5mg。分別稱取牛血清白蛋白相對分子質量標準物質、細胞色素C相對分子質量標準物質和β乳球蛋白各約5mg，溶解于10mL流動相[0.05mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH6.8)–0.3mol/L氯化鈉溶液]中，配制成混合標準溶液(以下簡稱混標C)。稱量約5mg待測蛋白樣品，溶解于10mL流動相中。將Biorad混標、混標C及待測蛋白樣品分別用0.45μm的醋酸纖維素過濾膜過濾，上機測定。

　　1.3標準品的紫外吸收光譜

　　將相對分子質量標準品配制成適當濃度的溶液，在凝膠色譜儀中可以直接測得各種分離組分的色譜數據，根據測定結果選擇220nm作為檢測波長。根據所有被分析的標準品和蛋白質樣品的光譜數據，選擇300～330nm范圍的參比波長以獲得*佳響應值。

　　1.4色譜條件

　　高效凝膠排阻色譜柱：TSKgelG3000SWXL型(300mm×7.8mm);進樣體積：20μL;流動相：0.05mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH6.8)–0.3mol/L氯化鈉溶液，流速為1mL/min;檢測器：DAD;檢測波長：220nm;信號采集時間：15min。

　　1.5數據處理

　　采用Agilent1260化學工作站配置的GPCaddon數據處理軟件進行數據處理。在軟件中打開標準物質溶液的色譜圖，指定相應的色譜峰并輸入相應的相對分子質量標準物質的相對分子質量信息，采用線性擬合方法，軟件自動生成標準曲線。然后打開樣品溶液的色譜圖，選定使用的標準曲線及需要計算的相對分子質量分布范圍，軟件自動計算出樣品的相對分子質量(峰值相對分子質量Mp、數均相對分子質量Mn、重均相對分子質量Mw、Z均相對分子質量MZ)及相應的相對分子質量分布。使用色譜圖積分面積百分比法可得樣品的主組分占可檢出組分的比例約為85%。根據軟件計算出的相對分子質量及相對分子質量分布情況，該牛血清白蛋白樣品中主組分在60～80kDa相對分子質量范圍的Mp為7.3211×104Da，其相對分子質量分布指數D在1.0092～1.0096之間，滿足D小于1.10的條件，見圖1。

　　2結果與討論

　　2.1標準物質和流動相的選擇

　　分別使用混合色譜標準品、牛血清白蛋白相對分子質量標準物質、馬心肌紅蛋白相對分子質量標準物質、細胞色素C相對分子質量標準物質、β乳球蛋白、鐵蛋白、過氧化物酶、雞卵清白蛋白、核糖核酸酶A，選取3種流動相配比進行試驗：T1流動相為0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH6.7)–0.1mol/LNa2SO4溶液;T2流動相為0.05mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH6.8)–0.3mol/LNaCl溶液;T3流動相0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液(用NaOH溶液調至pH6.8)–0.2

　　mol/LNaCl溶液。將上述標準品分成若干組，分別混合，并在相應的流動相中溶解后進樣。試驗發現，過氧化物酶與Biorad混標中的雞卵清白蛋白、核糖核酸酶A與Biorad混標中的細胞色素C在色譜中的保留體積非常接近而且相對分子量相對偏差不超過10%，所以予以剔除[9]。由于鐵蛋白的純度不佳、維生素B12為非采樣點，所以將二者剔除。所選蛋白標準物質在3種流動相條件下線性擬合曲線的相關系數r2分別為0.9883，0.9953，0.9946。選用Biorad混標和混標C，在T2流動相條件下，分兩組進樣，可達到基線分離且峰形較好，如圖2。相對分子質量對數值y與保留體積x(mL)的線性方程為y=–0.3302x+7.9618，線性相關系數r2為0.9953

　　2.2檢測波長的選擇

　　使用DAD檢測器可直接獲得選用蛋白質樣品在210～400nm范圍內的光譜數據，如圖3。由圖3可以看出，所有選用的蛋白質樣品都在280nm處有吸收峰，而在220nm處的吸光度要遠高于280nm處。馬心肌紅蛋白和細胞色素C在340～400nm附近吸光度逐漸高于280nm處的吸光度。因此選擇220nm作為檢測波長、300～330nm作為參比波長可以避免負峰的出現和獲得較高的靈敏度。

　　2.3測量精密度和準確度

　　采用T2流動相和優選的7種蛋白制作標準曲線，對牛血清白蛋白樣品主組分中相對分子質量60～80kDa范圍的蛋白分布進行測定。連續兩天，進行3組平行試驗，每組均采用Biorad混標和混標C新制作一條校準曲線。**天進樣一組，進樣1次，平行進樣3針;第二天進兩組，每組進樣3次，每次平行進樣3針。計算測定結果的平均值及組內和組間相對標準偏差，數據見表1。由表1數據計算得該方法組內總平均值為83.410%，相對標準偏差為0.004%～0.014%;組間相對標準偏差為1.89%，選定顯著水平α=0.05，經過F檢驗可以判定3組數據的精密度沒有顯著差異，屬于等精密度測量。測量精密度可以滿足一般實驗室對牛血清白蛋白的相對分子質量分布測定的要求。

　　選定顯著水平α=0.05;將3組數據進行互相比對，自由度f1–2，f1–3，f2–3分別為10，10，16;根據公式計算合并樣本方差Sp(1–2)，Sp(1–3)，Sp(2–3)分別為0.007，0.006，0.004;根據公式計算統計量結果，并查表，結果為t1–2=228.11>t0.05，10=2.23，t1–2=622.48>t0.05，10=2.23，t1–2=807.67>t0.05，16=2.16。經過t檢驗可判定組間測量結果存在不可忽略的差異，這說明用凝膠排阻色譜法測定牛血清白蛋白相對分子質量分布的方法，在不同組進行測量時存在一定的系統誤差，測量結果具有參考價值。由于目前測量相對分子質量分布沒有參考標準，所以對于該方法的準確度評價可以考慮使用校準曲線計算出某種蛋白的相對分子質量與其參考值進行比對。采用牛血清白蛋白相對分子質量標準物質作為樣品，連續6天，分6組進樣。根據相對分子質量對數值y與保留體積x(mL)的線性方程為y=–0.3302x+7.9618，計算出該樣品的Mp，以標準物質證書給定的值66446Da作為Mp的參考值，計算其相對誤差，并得出均值的相對誤差為7.76%，見表2。結果表明，通過校準曲線計算出的Mp值與參考值有一定程度的偏離，使用該方法對樣品分子量的測量具有參考價值。

　　2.4不同來源的同種蛋白保留時間差異性考察

　　分別將不同來源和相同來源的牛血清白蛋白質分組進樣檢測，計算測量結果，并對測量結果進行F檢驗和t檢驗[10–11]，檢驗結果見表3和表4。選定顯著水平α=0.05進行雙側F檢驗和t檢驗。F檢驗結果表明，無論是否同種來源的蛋白其測量屬于等精度測量。t檢驗結果表明，分別來自中國計量科學研究院(表3中簡稱計量院)和Sigma公司(表3中簡稱Sigma)的牛血清白蛋白其淋洗體積差異顯著;對同種來源的牛血清白蛋白，組1和組2之間的淋洗體積差異不顯著，