含量測(cè)量是核酸測(cè)量的首要問(wèn)題，世界工業(yè)先進(jìn)國(guó)家計(jì)量機(jī)構(gòu)均已針對(duì)核酸含量測(cè)量開(kāi)展了基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究。核酸含量測(cè)量應(yīng)用廣泛，包括實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)、基因芯片、電化學(xué)傳感器和納米技術(shù)等。這些技術(shù)領(lǐng)域質(zhì)控體系的建立，需要依照權(quán)威測(cè)量和計(jì)量方法研制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用保證核酸測(cè)量量值的溯源與傳遞。

　　目前國(guó)際上現(xiàn)有的具有明確溯源途徑的高準(zhǔn)確性核酸測(cè)量方法有酶解DNA產(chǎn)物的液相色譜–串聯(lián)同位素稀釋質(zhì)譜方法HPLC–IDMS[1–4]和DNA中磷元素的電感耦合等離子體發(fā)射光譜法ICP–OES[5–7]。

　　DNA酶解法可適用于長(zhǎng)片段核酸，但依賴于DNA水解酶的活性，而酶活性受酶解底物濃度的影響[8]。遇到核酸卷曲、核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合[9]、堿基修飾[10]等因素造成的特殊空間構(gòu)象時(shí)，核酸水解酶無(wú)法進(jìn)入而無(wú)法水解[8]。酶解反應(yīng)使DNA測(cè)量體系內(nèi)混入大量的蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽、兩性電解質(zhì)等物質(zhì)，純化過(guò)程容易導(dǎo)致DNA損失。文獻(xiàn)報(bào)道，DNA酶解反應(yīng)容易反應(yīng)不完全，導(dǎo)致*終測(cè)量結(jié)果偏低[10]。DNA中磷元素的電感耦合等離子體光譜法(ICP–OES)適用于短片段、純度很高的DNA樣品。如果DNA測(cè)量體系中混有其它元素狀態(tài)的磷，如無(wú)機(jī)鹽中的磷元素，則會(huì)造成DNA測(cè)量結(jié)果偏高[5]。

　　加熱可使得某些帶修飾的堿基從DNA骨架上解離出來(lái)成為游離堿基[11]。在強(qiáng)酸如HCl條件下，DNA上的堿基與核糖連接的糖苷鍵斷裂，形成游離堿基[12]，但是容易產(chǎn)生副產(chǎn)物。弱酸(如甲酸)在加熱條件下可使得DNA上腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤及其修飾加合物解離為游離堿基[13–14]，該過(guò)程也可解離出游離胞嘧啶和甲基胞嘧啶，用于DNA甲基化水平研究[15]。在此基礎(chǔ)上，筆者建立了DNA水解產(chǎn)物的HPLC–IDMS定量方法。

　　核酸的酸水解方法有以下優(yōu)點(diǎn)：

　　(1)酸解反應(yīng)耗時(shí)較短，反應(yīng)充分;

　　(2)酸解切斷的是堿基與核糖之間的糖苷鍵[13]，不受DNA長(zhǎng)度、序列、DNA上結(jié)合的蛋白質(zhì)等因素的影響，水解過(guò)程進(jìn)行較充分;

　　(3)酸解反應(yīng)不引入雜質(zhì)，只有甲酸中攜帶的痕量金屬離子，易于采用液相色譜串聯(lián)同位素稀釋質(zhì)譜的分離分析。然而酸解法也有一定的缺點(diǎn)，高濃度強(qiáng)酸可能使DNA的水解產(chǎn)生其它反應(yīng)副產(chǎn)物，可能造成堿基進(jìn)一步降解[16]。因此需要利用選擇酸的類型、酸的濃度、酸解時(shí)間與溫度，準(zhǔn)確控制酸水解效率，以實(shí)現(xiàn)DNA含量的準(zhǔn)確測(cè)量。

　　噬菌體λDNA是一種廣泛應(yīng)用的核酸含量標(biāo)準(zhǔn)品，常用于DNA紫外或熒光定量方法的校準(zhǔn)。噬菌體λDNA的提取純化過(guò)程需要先分離病毒顆粒，因此很少受到細(xì)菌本身基因組DNA和RNA的污染，可以獲得較純凈的噬菌體DNA[17]，適合作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物。

　　1實(shí)驗(yàn)部分

　　1.1主要儀器與試劑

　　水浴鍋：DK–8D型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;

　　pH計(jì)：Origin3Star型，美國(guó)ThermoScientific公司;

　　旋渦振蕩儀：MS3型，德國(guó)IKA公司;

　　真空干燥箱：DZF–6050型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;

　　恒溫烘箱：UFE500型，德國(guó)Memmert公司;

　　離心機(jī)：3–15K型，美國(guó)Sigma公司;

　　純水機(jī)：MilliQ型，美國(guó)Millipore公司;

　　分析天平：CP324S型，感量為0.01mg，德國(guó)Sartorius公司;

　　精密分析天平：UMX2型，感量為0.1μg，瑞士MettlerToledo公司;

　　電噴霧三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀：TSQVantage型，美國(guó)ThermoScientific公司;

　　SDS、酚、氯仿、異丙醇、乙醇、瓊脂糖、無(wú)機(jī)酸、無(wú)機(jī)鹽：分析純或優(yōu)級(jí)純;

　　乙腈、甲醇：色譜醇，美國(guó)J.T.Baker公司;

　　純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：自制，分別是腺嘌呤(Ade)[純度為(99.40±0.68)%，k=2]，胞嘧啶(Cyt)[純度為(99.58±0.72)%，k=2]，鳥(niǎo)嘌呤(Gua)[純度為(99.96±0.18)%，k=2]，胸腺嘧啶(Thy)[純度為(99.67±0.24)%，k=2]。其中腺嘌呤和胞嘧啶分別采用電位滴定法定值，量值溯源至酸堿國(guó)家基準(zhǔn)，鳥(niǎo)嘌呤和胸腺嘧啶采用液相色譜面積歸一化法定值;

　　同位素標(biāo)記物：13C，15N雙標(biāo)記堿基，同位素標(biāo)記腺嘌呤(L-Ade)化學(xué)式為1，3-15N298%，同位素標(biāo)記胞嘧啶(L-Cyt)化學(xué)式為2，4-13C2，15N3(99%C，98%N)，同位素標(biāo)記鳥(niǎo)嘌呤(L-Gua)化學(xué)式為8-13C，7，9-15N2(98%C，98%N)，同位素標(biāo)記胸腺嘧啶(L-Thy)化學(xué)式為1，3-15N2，98%，均購(gòu)自劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室(CambridgeIsotopeLabotory)公司。

　　1.2儀器工作條件

　　1.2.1色譜條件

　　色譜柱：AcqurityUPLCHSST3色譜柱(100mm×2.1mm，1.8μm，美國(guó)Waters公司);

　　流動(dòng)相：A為5mmol/LNH4Ac(0.1%HAc，pH4.0)，B為乙腈,水相配制后用0.45μm濾膜抽濾，并超聲脫氣;

　　柱溫：30℃;進(jìn)樣體積：3μL;

　　流速：120μL/min;梯度洗脫：0～9min99%A，9～9.5min99%～80%A，9.5～12.5min80%A,12.5～13min80%～99%A，13～18min99%A。

　　1.2.2質(zhì)譜條件

　　正電模式;噴霧電壓：3.0kV;霧化氣：N2;霧化氣溫度：200℃;鞘氣壓力傳感器參數(shù)：20arb;輔助氣壓力傳感器參數(shù)：5arb;毛細(xì)管溫度：350℃;碰撞氣：Ar;一級(jí)質(zhì)譜掃描寬度(m/z)：0.002;掃描時(shí)間：0.1s;一級(jí)質(zhì)譜半峰寬(FWHW)：0.7;二級(jí)質(zhì)譜半峰寬：0.7;微掃描時(shí)間：1ms。質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)的樣品離子監(jiān)測(cè)條件(包括同位素堿基標(biāo)記物)見(jiàn)表1。按質(zhì)譜儀說(shuō)明書(shū)配制含有咖啡因、MRFA(多聚酪氨酸短肽)和MLtramarkl621的質(zhì)量軸校準(zhǔn)液，完成質(zhì)譜儀的校準(zhǔn)。

　　1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的配制

　　稱取約1mg堿基和同位素標(biāo)記的堿基，分別溶于10mL去離子水中，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。Gua和L-Gua不易溶于水，溶于體積分?jǐn)?shù)3%的鹽酸溶液中，然后配制成混合標(biāo)準(zhǔn)品和混合同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)品。根據(jù)λDNA用HPLC外標(biāo)法測(cè)得的濃度，在溶液中添加約等量的混合同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)品，同時(shí)配制與樣品濃度近似的堿基與同位素標(biāo)記堿基質(zhì)量比值約為0.90和1.10的高標(biāo)和低標(biāo)溶液。

　　1.4DNA水解

　　將基因組DNA含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物凍干粉溶于100μL水，在λDNA溶液中添加與其組成成分核苷酸含量相近的標(biāo)記核苷酸混合物。量取100μL樣品溶液于安瓿瓶中，真空干燥箱抽干。加入200μL甲酸水溶液(體積分?jǐn)?shù)為88%)，充氮?dú)猓饪凇Ｔ?70℃恒溫烘箱內(nèi)反應(yīng)30min，冷卻后用真空干燥箱抽干，量取加入100μL0.1mol/L鹽酸溶解，充分溶解混勻，溶液于4℃下保存。

　　1.5IDMS法堿基含量的計(jì)算

　　針對(duì)每一種堿基：

　　式中：

　　c——堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù);

　　h——水解效率，%;

　　P——堿基標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度，%;

　　mr——樣品中堿基同位素標(biāo)記物的質(zhì)量，g;

　　Rs——樣品中堿基與堿基標(biāo)記物的峰面積比;

　　I1——高標(biāo)溶液堿基與堿基標(biāo)記物的質(zhì)量比;

　　I2——低標(biāo)溶液堿基與堿基標(biāo)記物的質(zhì)量比;

　　R1——高標(biāo)溶液堿基與堿基標(biāo)記物的峰面積比;

　　R2——低標(biāo)溶液堿基與堿基標(biāo)記物的峰面積比;

　　m——樣品質(zhì)量，g。

　　1.6λDNA含量的計(jì)算

　　由于λDNA是一個(gè)具有49.5kb長(zhǎng)度的雙鏈閉環(huán)DNA。Cyt，Gua，Thy，Ade4種堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.96%，12.19%，10.23%，10.97%，根據(jù)4種堿基含量計(jì)算得λDNA總質(zhì)量，取平均值，得到同位素稀釋堿基法測(cè)量DNA質(zhì)量的值。

　　2結(jié)果與討論

　　2.1DNA水解條件的優(yōu)化

　　分別用5%鹽酸溶液于110℃水解24～48h，用88%甲酸水溶液于140℃水解2～16h，用88%甲酸水溶液于170℃水解15min～4h[13–14]。試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸水解產(chǎn)物雜質(zhì)較多;甲酸140℃水解胸腺嘧啶核苷一磷酸的水解不完全;甲酸170℃水解效果較好，水解反應(yīng)完全。用88%甲酸水溶液于170℃水解30min回收率滿足要求，水解產(chǎn)物中4種堿基保持穩(wěn)定，因此水解條件優(yōu)化為88%甲酸水溶液于170℃水解30min。

　　2.2水解效率

　　根據(jù)核苷酸和基因組DNA水解實(shí)驗(yàn)的回收率計(jì)算酸水解回收率。微生物基因組DNA提取樣品中定量加入已知濃度的5種堿基混合物質(zhì)控品，以1.4步驟水解樣品并進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)測(cè)量7個(gè)樣品，計(jì)算回收率，結(jié)果表明4種待測(cè)物堿基的回收率都在95%以上，水解效率不確定度不大于0.8%。經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn)，4種dNMP溶液與λgDNA溶液添加dNMP溶液后水解測(cè)量的回收率無(wú)顯著性差異。另外，經(jīng)過(guò)Picogreen熒光染料實(shí)驗(yàn)，水解產(chǎn)物沒(méi)有出現(xiàn)熒光反應(yīng)，說(shuō)明水解產(chǎn)物中已不含有雙鏈DNA，即說(shuō)明水解反應(yīng)完全。

　　2.3色譜與質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

　　測(cè)試不同NH4Ac溶液濃度和不同pH值條件下4種堿基的分離效果，結(jié)果表明，pH值越大，堿基保留時(shí)間越長(zhǎng);有機(jī)相比例越高，堿基保留時(shí)間越短。考慮出峰時(shí)間、色譜柱的耐受性和流動(dòng)相對(duì)質(zhì)譜的影響，確定了1.2.1色譜條件。配制0.01mg/g同位素標(biāo)記的堿基和非標(biāo)記堿基的混合物，進(jìn)行流動(dòng)注射，選定合適的噴霧電壓和毛細(xì)管溫度，并且優(yōu)化S-lens和碎裂CID電壓，考慮質(zhì)譜的掃描速度、分析時(shí)間，獲得盡可能大的信號(hào)強(qiáng)度，確定了1.2.2質(zhì)譜條件。利用樣品與同位素標(biāo)記物混合后水解的產(chǎn)物進(jìn)行HPLC–IDMS實(shí)驗(yàn)，樣品總離子流圖和子離子流圖分別見(jiàn)圖1~圖5。

　　2.4樣品中堿基含量的同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定

　　取15支λDNA凍干粉樣品，稱量后溶于100μL去離子水中，然后量取100μL樣品溶液，加入100μL同位素標(biāo)記混合樣，充分混勻。參照1.4步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果列于表2，由表2可知，4種堿基測(cè)量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都在5%以內(nèi)。

　　按照1.6λDNA計(jì)算方法，依據(jù)不同核苷酸在整個(gè)λDNA序列中的比例計(jì)算λDNA含量，將4種核苷酸堿基推算所得DNA含量取平均值，并與數(shù)字PCR(dPCR)測(cè)量結(jié)果相比較[18]，結(jié)果見(jiàn)圖6。λDNA的測(cè)量結(jié)果為每支(2.51±0.06)μg

　　(k=2)。由圖6可見(jiàn)，兩種不同原理的測(cè)量方法所得結(jié)果近似，測(cè)量值在不確定度范圍內(nèi)。