利尿劑通常在一些病理狀況下用作治療藥物以排出體內流體，其不僅能促使腎臟排泄水和鹽，同時也影響腎臟吸收和排泄其它離子如鉀、鈣、鎂等。由于其作用迅速、強大而短暫，被廣泛地用于畜禽養殖中治療嚴重心、肝、腎性各類水腫，預防急性腎功能衰竭和加速毒物排出。若飼養者未經授權使用或者未遵循使用說明使用，可能導致其通過肉、奶進入消費者體內，危害消費者身體健康。長期食用含有利尿劑殘留的食物可能使尿中的鹽和電解質過度流失，破壞體內電解質平衡，嚴重時還會導致心律不齊或心臟衰竭而危及生命。因此有必要監控利尿劑在禽肉和奶中的殘留，以免消費者身體健康遭受危害。作為被批準用作奶牛養殖中治療奶牛乳腺及相關水腫的4種利尿劑之一，氯噻嗪不僅具有利尿作用，而且還具有降壓作用。我國農業部規定乳牛使用氯噻嗪的休藥期為72h，但目前還沒有規定氯噻嗪的容許量，FDA只有一個臨時性的安全水平限，規定氯噻嗪在牛奶中的限量為67μg/kg。目前，利尿劑殘留的檢測主要面向飼料、人及動物尿液、保健食品等，方法有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜–質譜法、液相色譜–質譜法[1–9]。液相色譜–串聯質譜法以其高靈敏度和可靠的確證性能，正得到越來越廣泛的應用。生鮮乳樣品含有大量的脂肪和蛋白，基質較為復雜，特別是前處理過程與一般樣品差異較大。筆者采用液相色譜–串聯質譜法測定生鮮乳中氯噻嗪殘留量，為養殖環節利尿劑藥物的監控及生鮮乳質量安全提供了技術保障。

　　1實驗部分

　　1.1主要儀器與試劑

　　氯噻嗪標準儲備液：100μg/mL，用甲醇配制，于冰箱中–20℃保存。根據需要用流動相將標準儲備液稀釋成適合濃度的標準工作溶液，現配現用;實驗用水為Milli-Q去離子高純水。

　　1.2樣品前處理

　　取5mL生鮮乳樣品至15mL離心管中，在4℃以2000r/min轉速離心10min，去除上層脂肪。脫脂后的樣品轉移至50mL離心管中，加入10mL乙腈和2mL5%乙酸鉛溶液渦旋混合沉淀蛋白，在4℃以5000r/min離心10min。取上清液至50mL離心管中，加入25mL水飽和的乙酸乙酯，渦旋混合，離心分層，有機相中加入5mL10%鎢酸鈉溶液，渦旋混合，離心分層，有機相在40℃下氮吹至近干，用流動相定容后過有機微孔濾膜，濾液供LC–MS/MS測定。

　　1.3儀器工作條件

　　1.3.1色譜條件

　　色譜柱：ZOBRAXSB–C18型(50mm×2.1mm，1.8μm);流動相：乙腈–0.1%甲酸溶液(體積比為30∶70)，流速為200μL/min;柱溫：30℃;進樣量：10μL。

　　1.3.2質譜條件

　　離子源：電噴霧離子源(ESI);掃描方式：負離子掃描;檢測方式：多反應監測(MRM);干燥氣溫度：350℃;干燥氣流速：10L/min;霧化器壓力：2.76×105Pa(40psi);毛細管電壓：4000V。*佳的碰撞電壓及定性離子對、定量離子對、保留時間及碰撞能量見表1。

　　2結果與討論

　　2.1樣品提取、凈化條件

　　生鮮乳中主要含脂肪、蛋白質、氨基酸和碳水化合物等，成分復雜，前處理過程與一般樣品差異較大。在進樣前需要進行必要的凈化處理，否則會干擾電噴霧過程的離子化程度，形成基質效應，從而影響測定結果的靈敏度和準確性。筆者在參考相關文獻[1–9]的基礎上，先在4℃下冷凍離心去除上層脂肪，再加入10mL乙腈和2mL5%乙酸鉛溶液作為蛋白沉淀劑。選擇乙酸乙酯作為提取劑，有機相在40℃下用氮氣吹至近干，用流動相定容，過有機微孔濾膜后供液相色譜串聯質譜儀分析。

　　以乙酸乙酯為提取劑進行冷凍離心，能較好地提取氯噻嗪，并去除干擾組分的影響。以空白樣品提取液做質譜全掃描，未發現有較大的基質干擾峰，說明本方法無明顯基質干擾，分析準確度高。

　　2.2色譜、質譜分析條件

　　由于氯噻嗪中含有多個*性基團，在一些色譜柱中會出現保留時間無規則的漂移。為了得到相對比較穩定的色譜保留時間，考察了AgilentZOBRAXSB–C18色譜柱，結果發現，氯噻嗪色譜峰形良好。另外，當流動相中添加0.1%的甲酸溶液時，氯噻嗪色譜峰形能得到進一步改善，離子化效率較高。對流動相流速進行考察，結果發現流速為0.2mL/min時離子化效率*高。液相色譜以0.2mL/min的流速將20.0μg/L的氯噻嗪標準溶液引入離子源，分別在正負離子模

　　式下進行工作，發現該化合物適合負離子模式，這是因為該化合物中含有羧基，更易于失去H+。在ES–條件下一級質譜分析得到[M–H]+分子離子峰，即選取m/z294.1為分子離子。再以20.0μg/L的標準溶液對質譜參數進一步優化，以獲得*佳的質譜條件。分別在120，130，140，150eV的碰撞電壓下對氯噻嗪的分子離子進行選擇性監測，比較不同碰撞電壓下分子離子的強度，確定氯噻嗪的*佳解離電壓為140eV。在140eV的碰撞電壓下，對分子離子進行二級質譜分析，比較不同碰撞能量對特征離子的影響，使特征離子強度達到*大，*終確定m/z179為定性離子，m/z214為定量離子，優化后的多反應監測條件見表1。在*佳實驗條件下，氯噻嗪的總離子流色譜圖、二級質譜圖、空白樣品總離子流圖分別見圖1～圖3。

　　2.3方法的線性范圍與定量限

　　在優化的測定條件下，配制一系列不同濃度的標準溶液進行測定。以目標物定量離子的峰面積(Y)對氯噻嗪濃度(X)繪制標準曲線。結果表明，在5～100μg/L范圍內，氯噻嗪的質量濃度和定量離子的峰面積呈良好的線性關系，相關系數為0.999，線性方程為Y=42394X–34647，氯噻嗪的定量限(S/N=10)為5μg/L。

　　2.4方法的精密度與回收率

　　在生鮮乳陰性樣品中加入適當濃度的氯噻嗪標準溶液，使加標量相當于10，50，100μg/kg，渦旋混合。每個添加水平按1.2和1.3的方法重復測定6次。實驗測得方法的回收率為86%～105%，相對標準偏差(RSD)為3.8%～7.5%。方法的測量精密度和加標回收率見表2。

　　3結論

　　用液相色譜–串聯質譜法測定生鮮乳中氯噻嗪殘留量，對凈化方法、色譜質譜條件進行了優化，該方法具有操作簡便，定性、定量準確，重復性好和靈敏度高的特點。能滿足生鮮乳中氯噻嗪殘留量的檢測要求，填補了國內檢測方法空白，為今后制定相關檢驗標準提供了參考依據。