黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉的代謝產物，是一種常見的腐生真菌，多見于發霉的糧食、糧食制品及其它霉腐的有機物上，其主要存在形式為B1，B2，G1，G2。在天然污染的食品中以黃曲霉毒素B1*為常見，其毒性和致癌性*強。1993年黃曲霉毒素被世界衛生組織(WHO)的癌癥研究機構劃定為一級致癌物，是一種毒性*強的劇毒物質[1]。研究表明，長期食用被黃曲霉毒素污染的食物將導致肝癌、胃癌、腸癌等疾病，為了防止黃曲霉毒素危害人類健康，世界各國對黃曲霉毒素在食品中的殘留限量做了嚴格的規定[2]。

　　黃曲霉毒素的檢測方法主要有薄層色譜法、酶聯免疫法和高效液相色譜法[3–5]。劉曉茂等[6]采用超高壓液相色譜串聯質譜法測定食用植物油中的黃曲霉毒素，該方法具有靈敏度高、選擇性強和定量結果準確等優點，但儀器較為昂貴，使用成本高，很難普及應用，且凈化過程繁瑣，需要消耗大量有機溶劑。筆者采用Mycosep228AflaPat多功能凈化柱處理樣品，應用光化學衍生，結合高效液相色譜法同時測定牛奶中的黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2。該法具有操作簡單、速度快、消耗溶劑少等優點，為實驗室開展黃曲霉毒素的檢測提供參考方法。

　　1實驗部分

　　1.1主要儀器與試劑

　　高效液相色譜儀：Waterse2695型，主要包括2475熒光檢測器、柱溫箱、自動進樣器、自動脫氣四元梯度泵等，美國Waters公司;光化學衍生器：HM11104型，北京華安麥科生物技術有限公司;氮氣吹干儀：HP–5016型，上海洛成分析儀器有限公司;漩渦混勻器：IKAMS3basic型，德國IKA公司;離心機：TDZ5–WS型，長沙湘智離心機儀器有限公司;超生波清洗機：SB–800DT型，寧波新芝生物科技有限公司;超純水系統：Milli-Q型，美國Millipore公司;多功能凈化柱(MFC)：Mycosep228AflaPat，美國RomerLabs公司;甲醇、乙腈：色譜純;黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2標準品：2.0μg/mL，美國Sigma公司;實驗用水為Millpore超純水系統制得。

　　1.2儀器分析條件

　　色譜柱：KromasilC18(250mm×4.6mm，5μm);流動相：甲醇–乙腈–水(體積比為25∶20∶55)，流速為1.0mL/min;進樣體積：20μL;柱溫：30℃;熒光檢測器：激發波長355nm，發射波長430nm。

　　1.3樣品預處理

　　準確稱取5g(精確到0.01g)試樣至50mL具塞離心管中，加入25mL乙腈–水混合溶液(體積比為80∶20)，漩渦混勻后超聲提取30min，以4000r/min離心10min，吸取10mL上清液至多功能凈化柱的玻璃試管中，將裝有填料的多功能凈化柱插入玻璃試管，并緩慢推動多功能凈化柱至玻璃試管的底部，上清液通過多功能凈化柱中的填料并與填料充分接觸，移取1mL通過多功能凈化柱的凈化液于另一玻璃試管中，60℃加熱,氮氣吹干，再加入1mL流動相溶解混勻，經0.45μm濾膜過濾后進樣分析。

　　2結果與討論

　　2.1凈化方法

　　多功能凈化柱(MFC)是一種特殊的固相萃取柱，其填料中含有親脂性(非*性)和電荷活性(*性)成分，可選擇性吸附樣品提取液中的脂類、蛋白質類化合物和碳水化合物等干擾物質，而讓待測化合物通過凈化柱，從而達到分離純化的目的[7]。多功能凈化柱操作簡便，不需要進行活化、淋洗和洗脫等操作，縮短了樣品的前處理時間。筆者選用美國RomerLabs公司的Mycosep228AflaPat多功能凈化柱，對牛奶樣品中的黃曲霉毒素進行分離純化，取得了十分理想的效果。

　　2.2提取方法

　　樣品的提取方法主要根據其物理化學性質來確定。黃曲霉毒素易溶于*性溶劑而不溶于非*性溶劑，且在中性溶液中較穩定，一般使用甲醇、乙腈、丙酮、氯仿或幾種有機溶劑的混合液對黃曲霉毒素進行提取。黃曲霉毒素雖然難溶于水，但是提取液中少量的水可以潤濕基質，增強有機溶劑在樣品中的滲透能力，因此采用有機溶劑與水的混合溶液作為提取劑，可以提高樣品的提取效率。分別以乙腈–水體積比為20∶80，40∶60，60∶40，80∶20和100∶0為提取劑對牛奶中黃曲霉毒素進行提取，結果表明，以乙腈–水體積比為80∶20時的提取效率*高，回收率在85%以上。

　　2.3衍生方法

　　高效液相色譜法已經成為檢測黃曲霉毒素的主要測定方法，但是黃曲霉B1和G1的熒光強度較弱，且黃曲霉毒素B1在水溶液中會發生熒光淬滅，因此需要采用衍生的方法增強B1和G1的熒光強度。常用的衍生方法有柱前三氟乙酸衍生[8]、柱后碘衍生[9]等，但衍生過程復雜、檢測靈敏度及重現性受人為因素影響較大。本實驗利用環狀化合物在紫外光照射下能產生熒光這一特性，采用光化學衍生技術，以流動相中的水作為衍生劑，對黃曲霉毒素進行衍生化處理，使流動相中的水與黃曲霉毒素B1作用，生成熒光特性更強、更穩定的化合物，從而解決了黃曲霉毒素B1在水溶液中發生熒光淬滅的問題，而且增加了黃曲霉毒素的熒光強度[10]。

　　2.4線性范圍和檢出限

　　分別稱取適量黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2標準品溶于甲醇，配成質量濃度為60ng/mL的標準儲備液。吸取適量體積黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的標準儲備溶液，用流動相稀釋配成相應濃度的混合標準溶液，并按選定的色譜條件進行分析。結果表明，黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的質量濃度與其峰面積具有良好的線性關系，其相關系數在0.9994～0.9999之間，相應的線性回歸方程見表1。在空白牛奶樣品中加入標準品，按上述方法處理樣品，根據3倍信噪比(S/N)峰的響應值計算，得到黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的檢出限分別為0.50，0.10，0.50，0.10μg/kg。牛奶加標樣品的色譜圖見圖1。

　　2.5回收試驗與精密度試驗

　　在牛奶空白樣品中加入3組不同濃度水平的黃曲霉毒素標準溶液，按實驗方法進行樣品處理和測定，考察實驗方法的回收率，并對加標樣品重復測定6次，考察實驗方法的精密度，結果見表2。結果表明，黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的回收率為85.6%～92.0%，測定結果的相對標準偏差(RSD)為1.72%～3.52%。

　　3結語

　　建立了一種以高效液相色譜–熒光檢測器同時檢測牛奶中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的方法。采用Mycosep228AflaPat多功能凈化柱對牛奶樣品中的黃曲霉毒素進行分離純化，并用柱后光化學衍生技術增加黃曲霉毒素的熒光強度。該方法具有簡便、快速、準確、靈敏度高等優點，為牛奶中黃曲霉毒素的檢測提供了實用的技術手段。