萬古霉素屬于萬古霉素類抗生素，是糖肽類化合物，其藥力較強，在其它抗生素對病菌無效時會被使用，但它有嚴重耳毒性及腎毒性。近年來，由于萬古霉素在畜禽和水產品養殖中的濫用，直接影響了以動物為原料的食品的質量安全。隨著動物性食品需求的急劇增長，抗生素類藥物的不合理使用和濫用，以及不遵守休藥期等多種原因所導致的動物性食品中藥物殘留問題不斷增多，對公眾健康的潛在危害日趨嚴重［1］。
目前，國內外還沒有制定動物性食品中萬古霉素藥物檢測的方法標準。文獻報道的檢測萬古霉素的方法僅有高效液相色譜法［2］。液相色譜的靈敏度低、定性不準確，而液相色譜–質譜聯用技術可顯著提高檢測的準確度、靈敏度，可提供豐富的結構信息，具有良好的應用前景。為此筆者建立快速高效檢測萬古霉素的液質聯用方法，該方法具有操作簡單、快速，精密度好，準確度高的優點。

1實驗部分

1．1主要儀器與試劑

串聯三重四級桿液質聯用儀：6410型，美國安捷倫公司；氮吹儀：HGC–12A型，天津市威儀科技發展有限公司；去離子水發生器：MilliQ型，美國Millipore公司；電子天平：CP225D型，*小分度值0.01mg，德國賽多利斯公司；HSE固相萃取儀：天津市恒奧科技發展有限公司；固相萃取小柱：OasisHLB型，顆粒度30μm，美國Waters公司；勻漿機：FS–1型，江蘇金壇市榮華實驗儀器廠；

冷凍臺式高速離心機：美國Thermo公司；多功能食品粉碎機：SG250A型，上海藝華電器廠；水浴恒溫振蕩器：SHA–C型，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；萬古霉素標準品：純度不低于96%，德國Dr.E公司；甲醇、乙腈：色譜純；甲酸、乙酸、乙酸銨：優級純；實驗用水為自制超純水；

1.2儀器分析條件

1.2.1色譜條件

色譜柱：AgilentEclipseplusC18(100mm×2.1mm，1.8μm)；流動相：水(A)–乙腈(B)；流速：0.4mL／min；梯度：0～0.5min5%B，0.50～2.0min5%～30%B，2.0～2.5min30%～90%B，2.5～3.0min90%B；后運行時間(posttime)：5min；柱溫：40℃；進樣量：5μL。

1.2.2質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：MRM多重反應檢測；氣體溫度：350℃，氣體流速：10L／mL；霧化器壓力：310.3kPa(45

psi);毛細管電壓：3500V；定性離子對(m／z)：724.9／99.8，724.9／144；定量離子對(m／z)：724.9／99.8；碎裂電壓：120V；碰撞能量分別分30V（m／z：724.9／99.8），6V（m／z：724.9／144）。

1.3溶液配制

萬古霉素標準儲備液：1g／L，精密稱取萬古霉素標準品適量，用甲醇–水（體積比5∶95）配制而成，于–20℃冰箱中保存。萬古霉素標準溶液：吸取適量萬古霉素標準儲備液，稀釋為10mg／L的標準中間溶液。吸取適量標準中間溶液，用與試樣基質相應的空白樣品提取液配制成1～500μg／L基質標準工作溶液，使用前配制。磷酸鹽緩沖溶液：稱取67.7g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）和1.5g磷酸二氫鉀（KH2PO4），用水定容至1000mL，配制成0.2mol／LpH8的磷酸鹽緩沖液。

1.4樣品前處理

1.4.1提取

準確稱取5g（精確至0.01g）樣品于50mL離心管中，加入磷酸鹽緩沖溶液20mL，勻漿器中高速勻漿提取2min，超聲提取10min，重復提取兩次，合并提取液，以4000r／min離心10min，濾紙過濾，待凈化。

1.4.2凈化

使用前將HLB固相萃取小柱依次過3mL甲醇、3mL水、3mL0.2mol／L磷酸鹽緩沖溶液活化，將待凈化上清液全部過柱，棄去濾液，用3mL磷酸鹽緩沖液、3mL水洗滌，*后用5mL乙腈洗脫并收集；洗脫液在45℃水浴中氮吹濃縮至近干，用流動相[水–乙腈(體積比為95∶5）]定容至1mL，旋渦混合后過0.22μm濾膜，濾液供HPLC–MS／MS測定［3］。

2結果與討論

2．1MS／MS條件優化

根據歐盟EC657［4］指令規定，對于液–質聯用方法，一個母離子（1.0識別點）加兩個特征子離子（2×1.5識別點）可以滿足對一個被分析物4個識別點的定性確證的要求。表1列出了萬古霉素的母離子、子離子等主要參數。

2．2液相色譜條件優化

對甲醇和乙腈兩種溶劑作為有機相進行了比較試驗。結果顯示，乙腈更有利于去溶劑化，且萬古霉素的響應值高，所以選擇乙腈作為流動相中的有機相。

水相分別用水、0.1%甲酸水溶液、5mmol／L甲酸銨溶液、0.1%甲酸、5mmol／L甲酸銨溶液，有機相用乙腈，梯度洗脫。綜合考慮峰形、分離度和響應值，選用水–乙腈為流動相。

2．3樣品前處理條件

動物性食品基質差異比較大，選取牛奶、豬肉作為典型基質進行加標試驗。提取方法主要為緩沖液提取、固相萃取凈化后再進樣分析。比較了磷酸鹽緩沖溶液和Na2EDTA–Mcllvaine(0.1mol／L，pH4.0)緩沖溶液［5］的提取效果。實驗發現前者能較好地提取出被測組分，且回收率較高，故選擇磷酸鹽緩沖溶液為提取液。

2．4線性關系、檢出限和定量限

精密稱取萬古霉素標準品適量，用甲醇–水(體積比5∶95)稀釋定容，配制成1g/L標準儲備液。依次吸取適量標準儲備液配制成濃度分別為1，10，50，250，500μg/L系列標準溶液。在選定的條件下對上述系列標準溶液進行測定，以目標化合物峰面積（Y）和對應標準溶液的濃度（X）進行線性回歸，得線性回歸方程為Y=947.34245X–1549.8701，相關系數r2=0.998，線性范圍為1～500μg／L。以信噪比S／N＝3計算方法的檢出限，以S／N＝10計算方法的定量限，經計算得檢出限為2μg／kg，定量限為7μg／kg。萬古霉素總離子流圖及其MRM定量離子提取色譜圖見圖1、圖2。

2．5回收率、精密度試驗

在牛奶、豬肉基質空白樣品中添加10，50，100μg／mL3個水平萬古霉素標準溶液進行加標回收試驗，結果見表3。由表3可知，3個水平加標回收率為84.8％～118.2％，相對標準偏差為2.2％～7.2％。由此可見本方法的精密度和準確度良好。加標樣品中殘留物的特征離子豐度比與標準物的特征離子豐度比之間的偏差在20%以內，滿足質譜方法的確證要求。

3結語

建立了動物性食品中萬古霉素殘留的液質聯用測定方法。該法重現性良好，操作簡便、結果準確，能滿足日常分析檢驗的需要，有利于提高動物性食品中抗生素殘留的檢測水平。