DHA和EPA因具有預防動脈硬化，防止血栓形成等功能［1］而被廣泛應用于保健行業。其中DHA能夠補腦健腦，提高視力，是大腦、視網膜神經系統中磷脂的主要成分，它對嬰幼兒智力與視力的發育有重要作用［2］。目前DHA，EPA的檢測方法主要有甲酯衍生化氣相色譜法［3］、高效液相色譜法［4］、薄層色譜法［5］等。筆者參照文獻建立了毛細管色譜法分析魚油保健品中功效成分DHA，EPA的含量，并參照國家規定方法［6］檢測DHA，EPA的穩定性，在魚油保健食品檢測中，毛細管色譜法與填充柱氣相色譜法相比具有分離度高、選擇性好、靈敏度高［7］等特點。

1實驗部分

1．1主要儀器與試劑

氣相色譜儀：CP–3800型，帶氫火焰離子化檢測器，美國Varian公司；氫氧化鉀–甲醇溶液：1.0mol／L；鹽酸–甲醇溶液：2.0mol／L；三氟化硼–甲醇溶液：14%～16%；脂肪酸標準品EPA，DHA甲酯：純度為99%，美國Sigma公司；飽和氯化鈉溶液：分析純；正庚烷：分析純；魚油樣品：某品牌魚油軟膠囊。

1．2色譜條件

色譜柱：DB–WAX毛細管柱（30m×0.530mm，1.00μm）；載氣：高純氮；載氣流速：15mL／min；柱溫采用程序升溫方式：初始溫度170℃，保持3min，以6℃／min升至210℃，保持14min。進樣口溫度：260℃；FID檢測器溫度：300℃；分流比為10∶1；進樣量：1μL。

2結果與討論

2．1實驗條件優化

2.1.1柱型選擇

實驗比較了填充柱、OV–101、SE–54、OV–17、DB–WAX柱的分離效果，結果表明，填充柱柱效低；OV-101，SE-54，OV-17柱分離效果差，不能滿足實驗要求；DB–WAX柱其柱內涂有高*性固定液且交聯，分離效能高，有較高的靈敏度。考慮到柱容量問題，選用0.53mmDB–WAX型色譜柱，某魚油樣品色譜圖如圖1所示。

2.1.2甲酯化方法

甲酯衍生化處理的目的是將脂肪酸各種酯轉化為甲酯，便于樣液汽化，在氣相色譜柱上得到有效分離。甲酯化常用方法有三氟化硼–甲醇溶液甲酯化法［7］、鹽酸–甲醇溶液甲酯化法［8］和氫氧化鈉–甲醇溶液甲酯化法［9］。(1)三氟化硼–甲醇甲酯化法：稱取約0.1g的魚油樣品，置于離心管中，加入2mL1.0mol／L氫氧化鉀–甲醇溶液，于65℃水浴加熱10min，期間振揺3次，至油滴完全消失。冷卻后加入2mL14%三氟化硼–甲醇溶液，于55℃繼續水浴加熱10

min。冷卻后加入5.00mL正庚烷，再加入2mL飽和食鹽水，振搖1min，以3000r／min離心10min分層，取上清液供氣相色譜測定。(2)鹽酸–甲醇甲酯化法：稱取約0.1g的魚油樣品，置于離心管中，加入2mL1.0mol／L氫氧化鉀–甲醇溶液，于65℃水浴加熱10min，期間振揺3次左右，至油滴完全消失。冷卻后加入2mL2mol／L的鹽酸–甲醇溶液，下同(1)。(3)氫氧化鉀–甲醇甲酯法：取約0.1g的魚油樣品，置于離心管中，加入2mL1.0mol／L氫氧化鉀–甲醇溶液，于65℃水浴加熱15min，期間振揺3次左右，至油滴完全消失冷卻后同(1)操作。不同甲酯化方法測定結果見表1。由表1可知，氫氧化鉀–甲醇甲酯化方法面積小,說明不能將樣品完全甲酯化；而三氟化硼–甲醇溶液與鹽酸–甲醇溶液對樣品甲酯化效果好，且差異很小，制備鹽酸–甲醇溶液麻煩且不穩定，因此筆者采用三氟化硼–甲醇甲酯化方法對樣品進行處理，方法操作簡便。值得注意的是三氟化硼有劇毒，操作時需要在通風櫥里操作，三氟化硼–甲醇溶液需冷藏保存。

2.1.3甲酯化時間

稱取約0.1g的魚油樣品5份，置于具塞磨口離心管中，加入2mL1.0mol／L氫氧化鉀–甲醇溶液，65℃水浴加熱10min，期間振揺3次左右，至油滴完全消失。冷卻后加入2mL14%三氟化硼–甲醇溶液，甲酯化反應時間分別為5，8，10，15，20min，下同2.1.2(1)。平行測定3次，取其平均值,結果見表2。

由表2可知，甲酯化反應8min后，峰面積基本不變，說明樣品在8min甲酯化反應已完全。實驗選擇甲酯化時間為10min。

2.1.4樣品甲酯化溶液的穩定性

稱取魚油樣品約0.1g，按甲酯化方法處理后，分別在室溫放置2，4，6，8，12h；在冷藏條件下放置1，2，3d，進行6次平行測定。結果表明，室溫放置條件下峰面積測定結果隨時間變化稍有提高；冷藏狀態下峰面積測定結果穩定，說明樣品甲酯化后冷藏狀態下放置至少在3d內穩定。

2.1.5載氣流速及分流比

試驗發現，當載氣流速為30mL／min或50mL／min時，一些組分分離差；流速為10，5mL／min時，樣品內各組分分離效果好但分析時間長(如流速為10mL／min時分析時間為32.3min)；流速為15mL／min時分析時間為21.7min。因此實驗選擇載氣流速為15mL／min。取適量樣品按照2.1.2(1)方法處理，分別在分流比為3∶1，5∶1，10∶1，20∶1，30∶1的條件下進樣檢測。當分流比為10∶1時，能獲得較好的分離效果和重現性。實驗選擇分流比為10∶1。

2.1.6進樣口溫度及柱溫

樣品甲酯化后，分別在進樣口溫度為160，180，200，220，240，260，300℃時進樣測定。當進樣口溫度為260，280，300℃時，峰面積大，峰型尖銳。考慮到溫度過高可能導致脂肪酸甲酯分子中雙鍵斷裂，230℃以下峰面積偏小揮發不完全，選擇進樣口溫度為260℃。取適量樣品按照2.1.2(1)方法進行處理，分別在160，180，200，220℃恒溫和120℃→210℃，150℃→210℃，170℃→210℃程序升溫（初溫保持3min，升溫速率為6.0℃/min）條件下進樣檢測，選擇*佳柱溫條件。結果表明，柱溫恒溫160℃時分離效果好，分析時間為2h；恒溫180℃時分析時間為61min，有些組分分離不好；恒溫200℃時，分析時間為24min，分離效果差，不能滿足分離要求。170℃→210℃程序升溫條件分離效果好，分析時間21.6min，為*佳柱溫條件。

2．2標準曲線方程

分別將20.0mg／mL的脂肪酸甲酯EPA標準溶液和DHA標準溶液用正庚烷逐級稀釋成質量濃度為20.0，10.0，4.0，2.0，1.0，0.5，0.25，0.125mg／mL的系列標準工作溶液，在選擇色譜條件下進行測定，每個濃度測定3次，取峰面積平均值。分別以EPA和DHA的峰面積（Y）對質量濃度（X，mg／mL）繪制標準曲線，線性方程、相關系數見表3。以S／N=3確定方法檢出限，EPA質量檢出限為0.6ng，DHA質量檢出限為1.2ng。

2．3檢出限

以S／N=3確定方法檢出限，EPA質量檢出限為0.6ng，DHA質量檢出限為1.2ng。

2．4回收率和精密度試驗

取魚油樣品按照2.1.2(1)方法處理后，進樣測定，重復6天，每天重復測定6次。考察方法日內重復性和日間重現性。EPA日內精密度為1.92%，日間精密度為3.26%；DHA日內精密度為1.21%，日間精密度為2.42%。向已知濃度的樣品溶液中分別加入一定量的低、中、高濃度的EPA，DHA標準溶液，按2.1.2(1)甲酯化后進樣測定，每個濃度重復6次。回收率結果見表4。由表4可知，EPA，DHA回收率分別為96.1％，97.8%，相對標準偏差小于3%，說明該方法重現性較好，精密度、準確度高。

2．5樣品的穩定性試驗

根據衛生部文件對產品保質期規定［6］進行穩定性試驗，即采用人工模擬條件進行試驗。產品保存溫度為37～38℃，相對濕度為70%～80%。分別在人工模擬條件下保存0，30，60，90d后，對3批樣品取樣，甲酯化后進樣分析，測定結果列于表5。由表5可知，樣品中DHA，EPA含量隨時間變化小，模擬條件90d后樣品中EPA,DHA含量約為當天(0d)所測含量的95%以上，表明魚油中功效成分DHA與EPA含量基本穩定。

2．6樣品測定

按2.1.2(1)方法對8個日常送檢的魚油樣品甲酯化后，在1.2色譜條件下進行測定，結果見表6。由表6可知，DHA含量在7.45%～41.03%之間，EPA含量在7.98%～71.78%之間，這8個樣品均為含DHA，EPA較豐富的魚油食品。

2．7面積歸一法與外標法結果比較

按面積歸一法與外標法計算樣品中DHA，EPA的含量，結果見表7。

由表7可知，外標法與面積歸一法計算結果相近，外標法計算結果變化較大，是由于進樣量為1.0μL，進樣要求高，有誤差產生，導致樣品中各組分的峰面積有變化；面積歸一法不受進樣量的影響。目前國內外采用氣相色譜法測定脂肪酸時定量法主要有外標法［8］、內標法［9］及面積歸一法［10］。國際上測定DHA或其它脂肪酸含量采用AOACOfficialMethod991.39(氣相色譜法微膠囊魚油與甲酯乙酯魚油中脂肪酸的測定)、AOACOfficialMethod996.06(食品中脂肪酸的測定)時，用內標法定量。GB／T17377采用面積歸一法測定脂肪酸含量［10］，面積歸一法要求各組分衍生化完全，且必須出峰，但對標準物質純度要求不高；外標法及內標法均要求標準物質純度高，而且內標法要求內標物是被測物中所不含有的組分并且性質相似。

3結語

采用毛細管氣相色譜法測定魚油中DHA和EPA的含量，該法準確、簡便，重現性好，可用于魚油類食品中脂肪酸的測定。