三聚氰胺（melamine）是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料，學(xué)名三氨三嗪，廣泛用于塑料、造紙、紡織、皮革、電器、涂料、醫(yī)藥等行業(yè)［1］。由于三聚氰胺（含氮量66%）與蛋白質(zhì)（平均含氮量16%）相比含有更高比例的氮原子，所以被造假者利用添加在食品中造成蛋白質(zhì)含量較高的假象［2］。我國在2008年發(fā)布并實施了《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》國家標準，其中包括液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等3種檢測方法［3］，其中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是采用基質(zhì)匹配的方法建立標準曲線，而基質(zhì)匹配方法存在以下不足：(1)不同品牌奶粉基質(zhì)各不相同，使用單一品種基質(zhì)容易造成差異并影響檢測結(jié)果；(2)因為實驗人員操作穩(wěn)定性問題，容易在樣品處理環(huán)節(jié)引入誤差，導(dǎo)致結(jié)果不準確。
筆者建立了一種同位素內(nèi)標測定方法，既可以運用同位素內(nèi)標物減少不同樣品基質(zhì)對檢測造成的干擾，又可以避免由于人員操作造成的誤差。運用該方法參加并通過了2012年度國家認監(jiān)委組織的“乳粉中三聚氰胺含量測定”能力驗證活動，結(jié)果表明該方法可靈敏、準確地對乳及乳制品中三聚氰胺進行檢測。

1實驗部分

1.1主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent1260型，配備Agilent在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱，美國安捷倫儀器公司；質(zhì)譜儀：Agilent6430型，配備電噴霧離子源，

三重四級桿質(zhì)譜儀，美國安捷倫儀器公司；氮氣發(fā)生器：N2LCMS–1CLAIND型，意大利Claind公司；固相萃取柱：AgilentPolymerSCXBox型，150mg，6mL，美國安捷倫儀器公司；氮吹儀：N–EVAPⅢ型，美國Organomation公司；高速離心機、超聲提取儀、渦旋振蕩器、微量移液器；高純氮氣：純度不小于99.999%；甲醇、乙腈、乙酸銨、氨水：色譜純；三聚氰胺標準物質(zhì)：純度不小于99.0%，德國Dr.公司；13C3–三聚氰胺（13C3–MEL）內(nèi)標物質(zhì)：純度不小于99.0%，德國Dr.公司；實驗用水：屈臣氏蒸餾水。

1.2液相色譜條件

色譜柱：AgilentRx-Sil色譜柱（50mm×2.1mm，1.8μm）；流動相：乙腈–水（體積比95∶5，含5mmol／L乙酸銨溶液），流速為0.3mL／min；柱溫：35℃；進樣量：10μL。

1.3質(zhì)譜條件

電噴霧離子源：ESI；模式：正離子；監(jiān)測：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；正電壓：300V；霧化氣壓力：275.8kPa（40psi）；干燥氣體流速：10L／min；干燥器溫度：350℃；毛細管電壓：4000V。甜蜜素的定性定量離子對、碎裂電壓、碰撞氣能量等參數(shù)見表1。

1.4樣品處理

稱取(1.00±0.01)g樣品于50mL具塞塑料離心管中，加入200μL100ng／mL內(nèi)標工作溶液及3mL水，渦旋混勻后加入7mL乙腈，渦旋混勻30s后超聲提取20min，再渦旋混勻后以5000r／min轉(zhuǎn)速離心10min。依次采用5mL甲醇、5mL水對固相萃取柱進行活化，以1mL／min流速將離心管中上清液5mL加入萃取柱，棄去流出液，然后用5mL水和5mL甲醇淋洗小柱，負壓抽

干。用6mol／Ll5%氨化甲醇（甲醇與氨水體積比95∶5）洗脫目標物，收集洗脫液，在50℃水浴中吹干，用1mL乙腈復(fù)溶混合均勻后，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，待測。

1.5實驗方法

1.5.1標準溶液制備

準確稱取適量三聚氰胺標準物質(zhì)，用50%甲醇水溶液配制成1.0mg／mL的標準儲備液，將標準儲備液再用50%甲醇水溶液稀釋成10μg／mL的標準中間液，再將其用乙腈逐級稀釋并加入適量內(nèi)標，配制成三聚氰胺質(zhì)量濃度為1.0，5.0，10.0，50.0，100.0ng／mL的系列標準工作溶液（均含內(nèi)標10ng／mL）。
1.5.2樣品測定

儀器按1.2，1.3條件穩(wěn)定后，分別取處理后的樣液和系列標準使用液各10μL進行測定，以面積積分，繪制標準曲線。三聚氰胺標準溶液的總離子流(TIC)譜圖見圖1。

2結(jié)果與討論

2.1樣品前處理條件

采用乙腈、甲醇水溶液、乙酸鋅水溶液和亞鐵氰化鉀水溶液沉淀蛋白并提取三聚氰胺進行比對試驗。實驗證明，采用甲醇水溶液提取，回收率很低；采用乙酸鋅水溶液和亞鐵氰化鉀水溶液沉淀蛋白時用量較大，重金屬殘留對色譜柱污染較嚴重［4］并干擾三聚氰胺的分離；乙腈沉淀效果較好，對檢測基本無干擾，故選用乙腈作為提取劑。同時試驗對比了WatersOasisMCX萃取柱和AgilentPolymerSCXBox萃取柱，結(jié)果無明顯差異，實驗選擇AgilentPolymerSCXBox萃取柱。試驗中發(fā)現(xiàn)個別萃取柱含有殘留，建議實驗前對小柱進行預(yù)清洗：活化后的小柱加入5%氨化甲醇淋洗，用負壓抽干，置于干燥處待用。含有殘留的萃取柱空白試驗譜圖見圖2。

2.2色譜條件的選擇

根據(jù)文獻［5–7］方法，三聚氰胺屬于強*性的小分子堿性化合物，可以選用親水相互作用色譜柱進行分離。實驗選用的AgilentRx-Sil色譜柱由高純度多孔硅膠微球制成，非常適于強親水化合物用高有機流動相以反相模式分離。該色譜柱需要較長的平衡時間（2～3h），否則將出現(xiàn)保留時間不重現(xiàn)的現(xiàn)象。在優(yōu)化色譜條件過程中，分別使用了乙腈–水（體積比80∶20，含5mmol／L乙酸銨溶液）、乙腈–水（體積比95∶5，含5mmol／L乙酸銨溶液）和甲醇–水（體積比90∶10，含1mmol／L乙酸銨溶液）3種體系的流動相組成，發(fā)現(xiàn)乙腈–水組成能夠得到更好的峰形和響應(yīng)值，同時分析時間*短，因此選擇其作為流動相。

2.3質(zhì)譜條件的選擇

根據(jù)三聚氰胺的分子結(jié)構(gòu)特征，選擇電噴霧離子源，在正離子模式下，**選擇全掃描模式找到適合本實驗所用設(shè)備條件的三聚氰胺及其同位素內(nèi)標物的母離子，然后用子離子掃描模式得到子離子，通過調(diào)整駐留時間、裂解電壓和碰撞氣能量得到較高的靈敏度，確定*佳實驗條件。實驗采用13C3–MEL作為內(nèi)標物［8］進行準確定量，以消除乳及乳制品中復(fù)雜的基質(zhì)干擾，保證結(jié)果的準確性。

2.4工作曲線方程與檢出限

實驗表明，在1.0～100.0ng／mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，以響應(yīng)信號即峰面積y為縱坐標，質(zhì)量濃度x為橫坐標進行線性回歸，得線性方程為y=1.140255x–

0.050629，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。將標準品溶液稀釋進樣，以響應(yīng)值等于3倍基線噪聲對應(yīng)的三聚氰胺濃度，計算得檢出限為1.0μg／kg，比GB／T22388–2008

標準中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法規(guī)定的0.01mg／kg的定量限降低了很多。

2.5回收試驗和精密度試驗

采用在空白樣品中添加標準溶液的方法進行回收試驗，兩個質(zhì)量濃度添加水平分別為10，20ng／mL，加標回收試驗結(jié)果見表2。同時用添加水平為10ng／mL的樣品重復(fù)測定6次，測試結(jié)果分別為9.9801，9.9844，9.9923，9.9904，9.9782，9.9889ng／mL，計算得測定結(jié)果的相對標準偏差為0.1%。準確度和精密度高于國標要求。

由表1、表2結(jié)果可知，采用外標法進行加標試驗，除不加內(nèi)標物外，樣品前處理步驟和加標量均相同，10ng／mL的樣品重復(fù)測定6次，測試結(jié)果分別為7.7210，7.9561，7.0013，7.0002，7.2487，7.8864ng／mL，計算得相對標準偏差為5.9%，加標回收試驗結(jié)果見表3。

由此可見，采用內(nèi)標法檢測得到的測量數(shù)據(jù)的精密度和準確度均有很大程度提高，測定結(jié)果良好。

2.6方法在能力驗證中的應(yīng)用

2012年筆者采用此法參加了山西出入境檢驗檢疫局組織的“奶粉中三聚氰胺和硫氰酸根分析能力驗證”活動（編號為PT01–005），中位值為A38.72，B10.175，C18.85，測試結(jié)果為A39.84，B10.95，C19.41，實驗室Z值的**值|Z|＜2，結(jié)果滿意。

3結(jié)語

通過使用內(nèi)標法降低了試樣的基質(zhì)干擾，減少了人為操作誤差，對三聚氰胺的檢測具有較高靈敏度，且方法的準確度和精密度較高，適用于乳及乳制品的分析檢測。不足之處是同位素內(nèi)標物價格昂貴，增加了檢測成本，不利于方法的推廣。