黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌毒素代謝產生的一類有毒的真菌毒素，廣泛存在于各種食品、農產品和飼料中，甚至堅果、乳制品、調味品等一些常見食品中也能經常發現黃曲霉毒素［1］。黃曲霉毒素具有*強的毒性和致癌性，可引發動物的肝癌、腎癌、胃癌等，其中黃曲霉毒素B1的毒性是氰化鉀的10倍，被確認為Ⅰ類致癌物［2］。我國對部分食品中黃曲霉毒素B1的限量標準：稻谷、大米、糙米不大于10μg／kg；豆類及其制品不大于5.0μg／kg；花生及其制品不大于10μg／kg；植物油脂(花生油、玉米油除外)不大于10μg／kg［3］。目前我國發布的國家標準黃曲霉毒素B1分析方法一般采用薄層色譜法、微柱篩選法、酶聯免疫法、熒光光度法、液相色譜法等［4–6］。微柱篩選法、熒光光度法普及率較低；薄層色譜法操作繁瑣費時，誤差較大；酶聯免疫法往往作為定性方法，檢測結果重復性差；液相色譜法采用衍生液衍生化法，衍生液對存放時間和環境都有要求且毒性較大，操作性差。筆者采用光化學柱后衍生器對黃曲霉毒素B1進行衍生，不需使用化學物質，不需沖洗步驟，沒有腐蝕性酸通過儀器，可延長液相色譜柱的使用壽命。該方法參加并通過了2012年度山西出入境檢驗檢疫局組織的“食用油分析能力驗證計劃”，表明該方法可靈敏、準確地對食品中黃曲霉毒素B1的含量進行檢測。

1實驗部分

1.1主要儀器與試劑

液相色譜儀：HITACHIL–2000型、配L–2485熒光檢測器、在線脫氣機、柱溫箱，上海天美科學儀器有限公司；光化學衍生反應器：PriboFastKRC–25型，北京泰樂琪生物科技有限公司；高速均質器：T8型，轉速為5000～25000r／min，德國IKA公司；甲醇：色譜純；實驗用水：屈臣氏蒸餾水；PBS緩沖液：稱取8.0g氯化鈉、1.2g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀，用990mL水溶解，用濃鹽酸調至pH7.0，*后用水定容至1000mL；吐溫20–PBS緩沖液：取1.0mL吐溫20，加入PBS緩沖液定容至1000mL；黃曲霉毒素B1標準物質：100μg／mL(乙腈基質)，北京泰樂琪生物科技有限公司；黃曲霉毒素B1免疫親和層析柱：PribofastCA–010–3mL型，北京泰樂琪生物科技有限公司。

1.2液相色譜條件

色譜柱：LachromC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇–水(體積比為45∶55)，流量為0.8mL／min；柱溫：25℃；激發波長：360nm；發射波長：420nm；進樣體積：20μL。

1.3樣品處理

如果是固體樣品，稱取(15.00±0.01)g粉碎的樣品；如果是油脂則直接取樣，無需處理。本次試驗采用的是市售大豆植物油。準確加入125.0mL提取液甲醇–水溶液(體積比為70∶30)及5.0g氯化鈉，以均質器高速攪拌2～3min后以4000r／min離心5min(或用槽紋濾紙過濾)，取15mL濾液加入30mL水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，收集全部濾液。

1.4免疫親和柱凈化

準確移取15.0mL濾液注入免疫親和柱，調節流速約1～2滴／s，待溶液完全流出后，分別用10.0mL的吐溫–PBS緩沖液和純水以約2～3滴／s流速清洗免疫親和柱，棄去全部流出液。用甲醇以1～2滴／s流速慢慢洗脫免疫親和柱中待測物質，收集全部洗脫液并定容至2.0mL，待測。

1.5實驗步驟

1.5.1標準溶液的制備

準確移取0.5mL黃曲霉毒素B1標準物質，用流動相定容至100.0mL，配制成質量濃度為500ng／mL的標準儲備液，再將其用流動相逐級稀釋，配制成黃曲霉毒素B1質量濃度分別為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0ng／mL的系列標準工作溶液。

1.5.2樣品測定

于開機前10min打開光化學衍生反應器，色譜儀按1.2色譜條件穩定后，分別取處理后的樣液和系列標準工作溶液各20μL進行測定，以色譜峰面積積分，繪制標準曲線。

2結果與討論

2.1樣品的前處理

黃曲霉毒素B1易溶于甲醇，因此采用甲醇–水溶液作為提取溶劑，能夠提高黃曲霉毒素B1的溶出率。免疫親和柱的高選擇性使樣品處理大為簡化，提取液用水稀釋的目的是減少甲醇對免疫親和柱的親和力的干擾，樣液過柱后用純水淋洗是為了去除非特異性雜質［7］。同時對比了Pribofast親和柱和Aflatest親和柱，結果無明顯差異，本實驗選擇Pribofast親和柱。對樣品進行衍生化的目的是為了增強黃曲霉毒素B1的熒光性，分為柱前衍生和柱后衍生。柱前衍生主要是采用試劑衍生，毒性大，不易保存，本試驗采用柱后光化學衍生法簡單易行，無污染。

2.2色譜條件的選擇

黃曲霉毒素B1屬于中等*性化合物，為了有利于色譜峰的分離和峰形的改善，分別采用DiamonsilC18和LachromC18色譜柱進行試驗，在優化色譜條件過程中，分別使用了乙腈–水(體積比為30∶70)、甲醇–水(體積比為45∶55)兩種體系的流動相，發現LachromC18色譜柱和甲醇–水(體積為45∶55)的流動相能夠得到更好的峰形和響應值，同時降低了檢測成本。流量設定為0.8mL／min是因為流速過大、壓力過高會縮短柱后光化學衍生器的使用壽命。優化條件后，樣品的峰形尖銳、對稱，分離效果較好。食用油添加黃曲霉毒素B1樣品色譜圖見圖1。

2.3線性范圍和檢出限

以響應信號即峰面積y為縱坐標，黃曲霉毒素B1溶液的質量濃度x為橫坐標進行線性回歸。實驗表明，黃曲霉毒素B1溶液的質量濃度在1.0～20.0ng／mL范圍內得線性方程為y=151100x–10290，相關系數r=0.9998。將標準品溶液稀釋進樣，以響應值3倍基線噪聲對應的黃曲霉毒素B1濃度計算得檢出限為0.1μg／kg，比GB／T18979–2003標準中

高效液相色譜法規定的1μg／kg的檢出限提高一個

數量級。

2.4回收試驗和精密度試驗

為驗證方法的準確性和可靠性，采用在空白樣品中添加標準溶液的方法進行回收試驗，3個質

量濃度添加水平分別為2，5，10ng／mL，同時每個質量濃度添加水平重復測定6次，加標回收和精密度試驗結果見表1。由表1可知，平均回收率為88.5%～97.9%，測定結果的相對標準偏差小于3%，說明該方法具有較高的準確度和良好的精密度。

3結語

建立的熒光色譜–柱后光化學衍生測定食品中黃曲霉毒素B1的方法，減少了試劑污染，簡化了樣品處理過程，對黃曲霉毒素B1的檢測具有較高的靈敏度，且方法的準確度和精密度均有很大

程度提高，適用于食品中黃曲霉毒素B1的分析檢測。不足之處是出峰時間較長，導致樣品檢測時間較長，可以通過更換不同長度規格的光化學衍生反應器來進行改善。