硝 基 呋 喃 類 藥 物 (Nitrofuran antibiotics) 作 為一類廣譜抗生素被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼料和治療藥物中，由于硝基呋喃在治療動(dòng)物腸胃病方面效果明顯，故被應(yīng)用于南美白對蝦育苗環(huán)節(jié)。研究表明該類藥物可能誘導(dǎo)有機(jī)體基因突變且具有遺傳毒性，歐美等國已將其列為違禁藥物，我國也將其列為食品動(dòng)物的禁用獸藥。硝基呋喃類藥物主要包括呋喃唑酮 (Furanzolidone)、呋喃西林(Nitrofurazone)、呋喃妥因 (Furantoin)、呋喃它酮 (Furaltadone)4 種，該類藥物在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)迅速分解，其代謝物可與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合形成穩(wěn)定殘留，因此目前通常以測定其代謝物的方式來說明硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)的含量。

南美白對蝦是寧波市水產(chǎn)養(yǎng)殖主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一，是寧波市水產(chǎn)品出口創(chuàng)匯的少數(shù)優(yōu)勢品種，因此保證南美白對蝦的食用安全對于保障百姓身體健康和擴(kuò)大出口至關(guān)重要。隨著百姓對食品安全問題的日益關(guān)注以及政府對水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管的重視，水產(chǎn)苗種作為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)重要的投入品，它的安全關(guān)系到水產(chǎn)品安全問題的源頭，也是各級漁業(yè)行政主管部門主抓的工作之一，因此測定南美白對蝦苗中的硝基呋喃類抗生素代謝物有重要意義。

近年來高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)越來越多地應(yīng)用于硝基呋喃類代謝物殘留的測定，與高效液相色譜紫外檢測器法比較，質(zhì)譜檢測技術(shù)采用多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM) 模式，結(jié)合液相保留時(shí)間及 MRM 特征離子對進(jìn)行定性和定量分析，可以大大減少由于保留時(shí)間相同而待測離子不同所帶來的干擾，并且提高了檢測靈敏度，尤其適合于基質(zhì)復(fù)雜樣品的分析，將這一技術(shù)應(yīng)用于南美白對蝦苗種硝基呋喃類代謝物殘留測定，將有利于漁業(yè)行政主管部門對水產(chǎn)苗種企業(yè)的監(jiān)管和水產(chǎn)品質(zhì)量安全的提升。目前尚無高效液相色譜 – 串聯(lián)質(zhì)譜法 (HPLC–MS／MS) 測定南美白對蝦苗種中硝基呋喃類抗生素代謝物的相關(guān)報(bào)道。確定了實(shí)驗(yàn)條件，所建方法測定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度滿足藥物殘留檢測要求。

1實(shí)驗(yàn)部分

1．1主要儀器與試劑

高 效 液 相 色 譜 – 質(zhì) 譜 聯(lián) 用 儀：Waters 2695–Quattro micro mass 型，美國 Waters 公司；

超聲波清洗機(jī)：KS–120D 型，寧波科生公司；均質(zhì)機(jī)：DJ– Ⅱ型，上海炳隆機(jī)電公司；

漩渦混勻儀：MS3 數(shù)顯型，德國 IKA 公司；恒溫水浴搖床：SHA–C 型，常州國華公司；

臺(tái)式離心機(jī)：DL–8M 型，上海離心機(jī)械研究所；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R215 型，瑞士 BUCHI 公司；

分析天平：BP211D Ma 型，感量為 0.000 1 g，德國 Sartorius 公司；

乙酸乙酯：分析純；乙腈、甲酸、2- 硝基苯甲醛：色譜純；鹽酸溶液：0.2 mol／L ；氫氧化鈉溶液：2.0 mol／L。

1．2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

AOZ，AMOZ，SEM · HCl，AHD · HCl 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度不低于 98% ；同位素內(nèi)標(biāo)溶液：AOZ-D4，AMOZ-D5，AHD-13C3和 SEM · HCl-13C-15N2，質(zhì)量濃度均為 100 μg／mL ；AOZ，AMOZ，SEM，AHD 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：質(zhì)量濃度均為 1.0 mg／mL，分別準(zhǔn)確稱取一定量 AOZ，AMOZ，SEM，AHD，用甲醇溶解并分別定容至10mL棕色容量瓶中，4℃冷藏保存；混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取 AOZ，AMOZ,SEM,AHD標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用流動(dòng)相[乙腈–甲酸緩沖溶液（體積比20∶80）]逐級稀釋配制成100 ng／mL和10 ng／mL混合溶液，于4℃冷藏保存；混合內(nèi)標(biāo)工作溶液：準(zhǔn)確吸取同位素內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇逐級稀釋配成 50 ng／mL 混合溶液，于4℃冷藏保存。

1．3樣品采集

南美白對蝦苗及對應(yīng)苗池水樣品取自2007～2011 年每年 4～5 月間，樣品采集覆蓋了寧波市慈溪、寧海、象山、鄞州、奉化等南美白對蝦苗主要生產(chǎn)區(qū)，涵蓋了寧波市大型育苗場的 95%，抽取苗種規(guī)格均為 0.7～1.0 cm 仔蝦。

1．4樣品前處理

取南美白對蝦苗樣用均質(zhì)機(jī)制成均質(zhì)糜樣備用，稱 取 樣 品 2.0 g( 精 確 到 0.01 g) 于 50 mL 離心管中，加入 200 μL 混合內(nèi)標(biāo)工作溶液，再加入10 mL 0.2 mol／L 鹽 酸 溶 液 和 100 μL 2- 硝 基 苯甲醛，渦旋振蕩 50 s 后，置于恒溫水浴振蕩器中37℃避光振蕩 16 h。取出離心管冷卻至室溫，加入1.0 mol／L 氫氧化鈉溶液約 2.0 mL，再調(diào)節(jié) pH 至7.0～7.5，加入 10 mL 乙酸乙酯，渦旋振蕩 50 s，以4 000 r／min 離心 5 min，取上層清液轉(zhuǎn)移至 50 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，再加入 10 mL 乙酸乙酯，重復(fù)上述操作，合并上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，準(zhǔn)確加入 1.0 mL乙腈 – 甲酸緩沖溶液（體積比 20∶80），渦旋振蕩溶解殘留物，過 0.45 μm 濾膜，待測。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制作時(shí)，用 100 ng／mL 和 10 ng／mL 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制系列標(biāo)準(zhǔn)使用液，不加樣品，其余等同樣品前處理過程。

1．5儀器工作條件

1.5.1色譜條件

色譜柱：SHISEIDO MG Ⅲ C18 柱 (2.0 mm×100mm) ；流動(dòng)相：乙腈 – 甲酸緩沖溶液 ( 體積比20∶80），梯度洗脫流速為0.2 mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：10 μL；進(jìn)樣時(shí)間：20 min。

1.5.2質(zhì)譜條件

離子化模式：大氣壓電噴霧離子源（ESI），正離子模式；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣流：600 L／h ；掃描模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測模式；選擇反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量。

2結(jié)果與分析

2．1衍生化時(shí)間對回收率的影響

衍生化時(shí)間的設(shè)定對樣品測定結(jié)果有很大影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)衍生化時(shí)間超過 12 h后，AOZ，SEM 回 收 率 較 好 且 穩(wěn) 定，而 AMOZ，AHD 衍生時(shí)間達(dá)到 16 h 才有穩(wěn)定的回收率。當(dāng)衍生時(shí)間小于 12 h 時(shí)，4 種硝基呋喃類代謝物不能保證每次都衍生完全，盡管 AOZ 在衍生化 6 h就能有較好回收率，但回收率并不穩(wěn)定，且并未隨時(shí)間的延長而呈比例增大。因此同時(shí)測定硝基呋喃 4 種代謝物時(shí)，應(yīng)選擇衍生時(shí)間大于 16 h。

2．2色譜柱的選擇

考察了 Waters atlantis C18(2.1 mm×150 mm)柱和SHISEIDO MGⅢC 18(2.0 mm×100 mm)柱對待測物的分離效果，結(jié)果表明， SHISEIDOMGⅢC 18柱靈敏度高于waters atlantisC 18柱，而waters atlantisC18柱的穩(wěn)定性較好，綜合考慮選擇SHISEIDO MGⅢC18柱。

2．3流動(dòng)相的選擇

考察了甲醇 – 水、乙腈 – 水、乙腈 –2 mmol／L乙酸銨、乙腈 –1‰甲酸溶液等不同流動(dòng)相對 4 種硝基呋喃代謝物的色譜行為和離子化程度的影響。結(jié)基呋喃代謝物的色譜行為和離子化程度的影響。結(jié)表明，以乙腈 –1‰甲酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，可獲得*優(yōu)的色譜分離效果和質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)。

2．4工作曲線方程、檢出限和定量限

配制質(zhì)量濃度為 0.2～50 ng／mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品的前處理方法進(jìn)行衍生化和提取后，利用高效液相色譜 – 串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測定。以色譜峰面積 (Y) 對被測組分的質(zhì)量濃度 (X) 進(jìn)行線性回歸，AOZ，AHD，SEM，AMOZ 的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。在陰性樣品基質(zhì)中添加 4 種標(biāo)準(zhǔn)溶液（AOZ，AMOZ 的 添 加 水 平 為 0.10 μg／kg，SEM，AHD 的添加水平為 0.25 μg／kg），當(dāng)信噪比 (S／N)于 5 時(shí)，計(jì)算 AOZ，AMOZ 的檢出限為 0.10 μg／kg，SEM，AHD 的檢出限為 0.25 μg／kg。在陰性樣品基質(zhì)中添加 4 種標(biāo)準(zhǔn)溶液（AOZ，AMOZ 的添加水平為 0.40 μg／kg，SEM，AHD 的添加水平為 0.50μg／kg），當(dāng) 信 噪 比 (S／N) 大 于 10 時(shí) 計(jì) 算 AOZ，AMOZ 的定量下限為 0.40 μg／kg，SEM，AHD 的定量下限為 0.50 μg／kg。

2．5方法回收率和精密度試驗(yàn)

選取陰性樣品，添加 4 種硝基呋喃類代謝物標(biāo)準(zhǔn)品和相應(yīng)內(nèi)標(biāo)，添加水平為 2.50，10.0 μg／kg，每個(gè)水平做 6 個(gè)平行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)回收率為 88.2％～97.6％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 4.6％～6.8％，由此可見方法的精密度和準(zhǔn)確度較高。

3結(jié)語

采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了南美白對蝦苗的硝基呋喃類代謝物測定方法，對樣品前處理的提取凈化條件、液相色譜分離條件和串聯(lián)質(zhì)譜測定條件進(jìn)行了優(yōu)化。該方法具有穩(wěn)定性好、靈敏度高的特點(diǎn)，其線性、準(zhǔn)確度和精密度均能滿足藥物殘留測定要求。該方法樣品前處理過程簡單、凈化效果好，適合于大批量樣品的快速檢測，該研究為政府相關(guān)部門對南美白對蝦苗硝基呋喃類代謝物的監(jiān)督提供了參考。

摘自化學(xué)分析計(jì)量