作者:宋檢 時間:2022-11-28 來源:互聯(lián)網(wǎng)
透射電鏡樣品制備方法
樣品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過夜,然后按下列步驟處理樣品:
倒掉固定液,用0.1M,pH=7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品三次,每次15min;
用1%的鋨酸溶液固定樣品1-2h;
倒掉固定液,用0.1M,pH=7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品三次,每次15min;
用梯度濃度(包括50%,70%,80%,90%和95%五種濃度)的乙醇溶液對樣品進行脫水處理,每種濃度處理15min,再用****的乙醇處理一次,每次20min;*后過度到純丙酮處理20min;
用包埋劑與丙酮的混合液(V/V=1/1)處理樣品1h;
用包埋劑與丙酮的混合液(V/V=3/1)處理樣品3h;
純包埋劑處理樣品過夜;
將經(jīng)過滲透處理的樣品包埋起來,70℃加熱過夜,即得到包埋好的樣品。樣品在Reichert超薄切片機中切片,獲得70-90nm的切片,該切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色15min,即可在透射電鏡中觀察。
TEM樣品包埋塊制作有關(guān)注意事項
一、取材:
1、動作迅速:組織離體后,應將其快速放入固定液中,使組織細胞盡可能保持原來的生活狀態(tài);
2、減少損傷:選擇鋒利切割器械,減少牽拉或擠壓組織;
3、組織塊大小:一般要小于1mm3。
二、固定:
固定是指用化學固定劑或一些物理方法迅速殺死細胞的過程,目的是盡可能保持細胞的原有生活狀態(tài),不發(fā)生位移,減少組織結(jié)構(gòu)變化。固定劑的主要作用是使蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子發(fā)生某種交聯(lián)。
1、用固定液固定的樣品若漂浮在溶液表面,應通過抽真空的方法讓樣品沉入溶液中
2、使用鋨酸的注意事項
(1)通風櫥中的鋨酸溶液為2%的儲備液,使用之前需用0.2MPBS或二甲砷酸鹽緩沖液稀釋成1%的鋨酸溶液。
(2)鋨酸為劇毒、*易揮發(fā)的試劑,必須在通風櫥中操作,廢液必須收集在密閉容器中。**次使用鋨酸的同學,請務必獲得老師或其它熟悉操作人員的指導。
三、漂洗:
應徹底漂洗干凈,減少固定液與固定液或與脫水劑之間的反應。
四、脫水:
脫水是將組織中的游離水徹底清除的過程。由于常用的包埋劑大都是非水溶性樹脂,只有將生物組織中的游離水清除干凈,包埋劑才能浸入組織。
脫水過程中應注意:
(1)逐級脫水而不能急劇脫水;
(2)更換溶液時動作要快,特別是不要讓組織離開溶液,否則會在組織內(nèi)外產(chǎn)生氣泡;
(3)脫水過程中若要長時間停留或過夜,應放在70%脫水劑中,并在4℃保存。
五、滲透
滲透就是用包埋劑逐漸取代組織中的脫水劑,使細胞內(nèi)外空隙被包埋劑所填充。包埋劑通常由樹脂、硬化劑、增塑劑及催化劑4種試劑按一定比例配制而成。
包埋劑配制及使用過程中的注意事項:
(1)所有容器及玻璃棒等應是清潔和干燥的;
(2)配制過程中應攪拌均勻,使用過程中應避免異物,特別是水、乙醇、丙酮等混入包埋劑;
(3)配制好的包埋劑應密封保存,避免受潮。剩余包埋劑可密封并儲存在-10—-20℃冰箱中,延長其使用期。23-10-20
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