礦化（mineralization）由成骨細(xì)胞（osteoblast）介導(dǎo)。作為脊椎動(dòng)物的一種基本過程，成骨細(xì)胞通過基質(zhì)囊泡（matrix vesicle, MV）分泌礦物質(zhì)前體。基質(zhì)囊泡富含鈣和磷酸鹽，含有酸性蛋白等有機(jī)物質(zhì)。

如今，在一項(xiàng)新的研究中，Tomoaki Iwayama及其在牙周病學(xué)、生物醫(yī)學(xué)研究、口腔科學(xué)、生物材料和口腔解剖學(xué)發(fā)展部門的同事們利用掃描電子輔助介電顯微鏡（scanning electron-assisted dielectric microscopy, SE-ADM）和超分辨率顯微鏡（super-resolution microscopy, SRM）在納米級(jí)分辨率下評(píng)估了礦化條件下的活的成骨細(xì)胞。根據(jù)他們的觀察結(jié)果，基質(zhì)囊泡能夠與溶酶體一起運(yùn)輸并通過胞吐作用加以分泌。Iwayama等人提供了溶酶體能夠在礦化的成骨細(xì)胞中運(yùn)輸無定形磷酸鈣的證據(jù)。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2019年7月3日的Science Advances期刊上，論文標(biāo)題為“Osteoblastic lysosome plays a central role in mineralization”。

在骨礦化的生理過程中，磷酸鈣晶體的沉積在胞外基質(zhì)中發(fā)生，這是所有脊椎動(dòng)物的一種基本過程。1967年，生物學(xué)家Clarke Anderson和Ermanno Bonucci利用電子顯微鏡分別在細(xì)胞外空間中可視化觀察了礦物相關(guān)顆粒。科學(xué)家們后來將這些顆粒識(shí)別為礦化納米囊泡或基質(zhì)囊泡。在過去50年的基質(zhì)囊泡研究中，生物學(xué)家們一直在努力了解基質(zhì)囊泡形成和分泌的機(jī)制，這種機(jī)制在很大程度上仍然未知。

利用電子顯微鏡闡明活細(xì)胞的礦化過程是具有挑戰(zhàn)性的，這是因?yàn)橛糜陔娮语@微鏡觀察的樣品制備需要化學(xué)固定和酒精脫水這兩個(gè)步驟。這些步驟能夠誘導(dǎo)人工贗品，甚至溶解或除去不穩(wěn)定的礦物質(zhì)前體，并留下稱為“晶體幻影（crystal ghost）”的有機(jī)支架。盡管科學(xué)家們已成功地對(duì)固定和脫水組織進(jìn)行電子顯微鏡成像來觀察骨中礦化膠原纖維的結(jié)構(gòu)，但是為了研究礦物質(zhì)前體，他們必須采用低溫電鏡過程來避免脫水，并且促進(jìn)較小的標(biāo)本*快地冷卻，此外，這種冷卻過程成本高昂。

為了克服當(dāng)前研究工作中的這些局限性，Iwayama等人使用了一種稱為SE-ADM的新型顯微鏡系統(tǒng)。這種方法之前已實(shí)現(xiàn)了在無染色的水介質(zhì)中對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行納米級(jí)分辨率的高對(duì)比度的成像。

這些研究人員使用這種相同的技術(shù)（高分辨率SE-ADM）探究了在完整的成骨細(xì)胞中觀察基質(zhì)囊泡的可能性，以了解基質(zhì)囊泡運(yùn)輸?shù)纳锇l(fā)生機(jī)制。對(duì)于成骨細(xì)胞系，他們使用了在體外和體內(nèi)具有較高成骨能力的小鼠成骨細(xì)胞系KUSA-A1。在適當(dāng)條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后，他們利用SE-ADM觀察這些細(xì)胞以鑒定正常的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。他們觀察到在成骨培養(yǎng)基中細(xì)胞生長4～10天后，基質(zhì)囊泡與膠原原纖維排列一致，并且由于融合或顆粒生長，分泌的顆粒大小增加了，它們的大小與之前的報(bào)道的相一致，這就表明它們確實(shí)是基質(zhì)囊泡。

在利用SE-ADM開展進(jìn)一步研究后，這些研究人員注意到溶酶體途徑參與轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌腔內(nèi)基質(zhì)囊泡的過程與外泌體中的相類似。有趣的是，外泌體和基質(zhì)囊泡都被歸類為具有相似大小的胞外囊泡；它們都可由成骨細(xì)胞分泌，并且在細(xì)胞間通信中具有共同的功能。

在下一步中，Iwayama等人探究了這些顆粒是否是含有鈣和/或磷酸鹽的基質(zhì)囊泡。為此，他們將這些細(xì)胞在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)了7天，并利用SE-ADM觀察它們，記錄到?jīng)]有小晶界面（crystal facet）的非常平滑的結(jié)構(gòu)。這表明基質(zhì)囊泡沒有結(jié)晶，仍然是無定形的，這也與之前研究中記錄的相一致。當(dāng)在一氮化硅（silicon mononitride, SiN）膜上檢測基質(zhì)囊泡時(shí)，這些研究人員觀察到對(duì)應(yīng)于磷、鈣、碳和氧元素的尖峰。他們使用拉曼光譜證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)：基質(zhì)囊泡中存在磷酸鈣。

這些研究人員還研究了低磷酸酯脢癥（hypophosphatasia）的影響。低磷酸酯脢癥是一種由Alpl基因（表達(dá)鏈堿性磷酸酶）編碼的疾病，在這種疾病中，成骨細(xì)胞在體外不會(huì)發(fā)生礦化。為此，他們使用CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)對(duì)成骨細(xì)胞的基因組進(jìn)行編輯，從而產(chǎn)生敲除Alp1 的成骨細(xì)胞克隆。當(dāng)他們利用高分辨率SE-ADM檢測這些成骨細(xì)胞克隆時(shí)，他們并沒有觀察到基質(zhì)囊泡，而且鑒于沒有對(duì)應(yīng)于磷和鈣的尖峰，他們通過光譜分析進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。

當(dāng)Iwayama等人利用高分辨率SE-ADM直接觀察基質(zhì)囊泡的產(chǎn)生和分泌之后，他們進(jìn)一步研究了溶酶體參與基質(zhì)囊泡的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸以便觀察活的成骨細(xì)胞的礦化。他們?cè)诤}的成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)了這些細(xì)胞，并用LysoTracker對(duì)它們進(jìn)行染色，以便檢測感興趣的細(xì)胞內(nèi)組分。他們找到了與溶酶體相匹配的含有鈣黃綠素（calcein）的囊泡，這就表明溶酶體內(nèi)的基質(zhì)囊泡的生物發(fā)生是在它們與含有鈣黃綠素的囊泡融合在一起后進(jìn)行的。他們隨后開展功能喪失和功能抑制實(shí)驗(yàn)，以便進(jìn)一步破解這些途徑，并在體外的活細(xì)胞礦化期間探究細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制。

科學(xué)家們之前已報(bào)道過，由于成骨細(xì)胞線粒體中存在電子致密的富含鈣和磷的顆粒，線粒體參與這種礦化過程。這一點(diǎn)可通過使用改進(jìn)的冷凍技術(shù)觀察到。此外，還有報(bào)道指出溶酶體和線粒體之間的直接接觸具有功能意義。當(dāng)Iwayama等人利用LysoTracker和MitoTracker對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，并在N-SIM結(jié)構(gòu)化照明（N-SIM structured illumination）超分辨率顯微鏡（SRM）下觀察這些細(xì)胞內(nèi)組分。他們觀察到大多數(shù)含有鈣黃綠素的囊泡位于線粒體附近，并且與溶酶體相匹配。在SRM時(shí)間推移成像（SRM-time lapse imaging）過程中，他們進(jìn)一步獲得了含有LysoTracker的囊泡與位于線粒體附近的靜態(tài)的含有鈣黃綠素的液泡融合在一起時(shí)的圖像，這就證實(shí)了他們的假設(shè)。

通過這種方式，再結(jié)合對(duì)其他SRM系統(tǒng)和其他細(xì)胞系的觀察，Iwayama等人提出了一種礦化機(jī)制。在這種機(jī)制中，溶酶體在成骨細(xì)胞內(nèi)的基質(zhì)囊泡生物發(fā)生和運(yùn)輸中起著重要作用。當(dāng)成骨細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)運(yùn)輸無定形磷酸鈣時(shí)，溶酶體參與運(yùn)輸而不結(jié)晶是合理的。這些研究人員的目標(biāo)是開展進(jìn)一步的研究，以便了解基質(zhì)囊泡的調(diào)控分子，并研究基質(zhì)囊泡和外泌體是否具有相似的組成以及在它們的產(chǎn)生和分泌和功能上是否具有相似的機(jī)制。這項(xiàng)研究中使用的SE-ADM能夠以較低的成本安裝到現(xiàn)有的掃描電子顯微鏡設(shè)備中。這項(xiàng)研究中開發(fā)的工具將在納米水平上提供適用于所有科學(xué)領(lǐng)域的非侵入性的高分辨率成像。