1.范圍

本標準規定了嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測定方法。

本標準適用于嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測定。

2.規范性引用文件

本標準中引用的文件對于本標準的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅所注日期的版本適用于本標準。凡是不注日期的引用文件,其*新版本(包括所有的修改單)適用于本標準。

**法 微生物法

3.原理

利用植物乳桿菌( Lactobacillus plantarun)ATCC 8014對泛酸的特異性,在含有泛酸樣品中生長產生的酸度和形成的光密度來測定泛酸的含量。

4.試劑和材料

除非另有規定,本方法所用試劑均為分析純試劑,水為GB/T 6682規定的二級水。

4.1 0.9%生理鹽水:9.0g氯化鈉溶解于1000mL水中,分裝于具塞試管中,每管10mL,121℃滅菌15min。每周準備一次。

4.2 泛酸鈣標準品。

4.3 乙酸溶液(0.2mol/L):吸取12mL冰乙酸用水稀釋至1000mL。

4.4 甲苯(C7H8)。

4.5 乙酸鈉溶液(0.2mol/L):溶解16.4g無水乙酸鈉于水中,稀釋至1000mnL。

4.6 菌株:植物乳桿菌(Lactobacillus plantarun)ATCC 8014。

4.7 培養基

4.7.1 乳酸桿菌瓊脂培養基:光解胨15g,酵母浸膏5g,葡萄糖10g,番茄汁100mL,磷酸-氫鉀2g,聚山梨糖單油酸酯1g,瓊脂10g,加蒸餾水至1000mnL,調pH至6.8±0.2(20℃～25℃)。

4.7.2 乳酸桿菌肉湯培養基:光解胨15g,酵母浸膏5g,葡萄糖10g,番茄汁100m,磷酸二氫鉀2g,聚山梨糖單油酸酯1g,加蒸餾水至1000mL,調pH至6.8±0.2(20℃～25℃)。

4.7.3 泛酸測定用培養基:葡萄糖40g,乙酸鈉20g,無維生素酸水解酪蛋白10g,磷酸氫二鉀1g,磷酸二氫鉀1g,L-胱氨酸0.4g,L-色氨酸0.1g,硫酸鎂0.4g,氯化鈉20mg,硫酸亞鐵20mg,硫酸錳20mg,硫酸腺嘌呤20mg,鹽酸鳥嘌呤20mg,尿嘧啶20mg,胡蘿卜素400μg,鹽酸硫胺素200μg,生物素0.8μg,p-氨基苯甲酸200μg,煙酸1mg,鹽酸吡哆醇800μg,聚山梨糖單油酸酯0.1g,加蒸餾水至1000mL,調pH至6.7±0.1(20℃～25℃)。

4.8 Tris緩沖液:稱取24.2g Trizma base于燒杯中,加200mL水溶解。

4.9 鹽酸(0.1mol/L):吸取8.3mL鹽酸,用水稀釋至1000mnL。

4.10 標準溶液

4.10.1 泛酸標準貯備液(40μg/mL):精確稱取45mg～55mg泛酸鈣標準品(4.2),溶入500mL蒸餾水中,加10mL乙酸溶液(4.3),加100mL乙酸鈉溶液(4.5),用水稀釋至泛酸鈣精確濃度為43.47μg/mL(即泛酸濃度為40μg/mL),加0.5mL甲苯(4.4)貯于2℃～4℃冰箱中,保存期為4個月。

4.10.2 泛酸中間貯備液(1μg/mL):取25mL標準貯備液(4.10.1),加入蒸餾水500mL,乙酸溶液10mL(4.3),乙酸鈉溶液100mL(4.5),再用水稀釋至1L。加0.5mL甲苯(4.4)貯于冰箱中(2℃～4℃),保存期為1個月。

4.10.3 泛酸標準工作液(10ng/mL,5ng/mL):吸兩次5.0mL中間貯備液(4.10.2),分別用水定容至500mL和1000mL,臨用前配制。

5.儀器和設備

5.1 分光光度儀。

5.2 pH計:精度為0.01。

5.3 渦旋振蕩器。

5.4 天平:感量0.1mg。

5.5 生化培養箱:36℃±0.5℃。

5.6 離心機:轉速≥2000轉/分鐘。

6.分析步驟

6.1 測試菌液的制備

6.1.1 把植物乳桿菌( Lactobacillus plantarun)ATCC 8014凍干菌粉轉入乳酸桿菌肉湯培養基(4.7.2)試管中,36℃±1℃培養24h。再轉接至乳酸杄菌瓊脂培養基(4.7.1)試管中,36℃±1℃培養24h

培養好的乳酸桿菌瓊脂培養基(4.7.1)試管的培養物作為貯備菌種。

6.1.2 從貯備菌種培養基上分別轉接到三個乳酸杄菌瓊脂培養基(4.7.1)試管中,放入培養箱中36℃±1℃培養24h。每月轉接一次,作為月接種管貯于冰箱中。每月定期從月接種管中重新接種3個轉接管保存新菌株。

6.1.3 從月接種的培養管中的一支再接種一支乳酸杄菌瓊脂培養基(4.7.1)試管,36℃±1℃培養24h,作為日接種管每日測定用。

6.1.4 從日接種管中接種一管乳酸桿菌肉湯培養基(4.7.2),36℃±1℃培養24h。在無菌條件下離心該培養液10min(2000轉/分鐘),棄去上清液。用10mL生理鹽水(4.1)振蕩洗滌菌體,離心10min(2000轉/分鐘),棄去上清液,用10mL生理鹽水(4.1)振蕩清洗。如前離心操作,棄去上清液。再加10mL生理鹽水(41),混勻。吸1mL該菌懸液于10mL生理鹽水(4.1)中,混勻制成測試菌液。

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