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多功能酶標儀成像功能檢測手冊

作者:百檢網 時間:2022-04-06 來源:互聯網

  多功能酶標儀指擁有多種檢測模式的單體臺式酶標儀。通常某些多用途高端型酶標儀支持標準1cm比色皿檢測,不僅僅微孔板可進行吸光度(Abs)、熒光強度(FI)、時間分辨熒光(TRF)、熒光偏振(FP)、和化學發光(Lum)檢測,并且從以上技術中衍生出多種檢測方法,主要包括時間分辨熒光共振能量轉移(TR-FRET)、AlphaScreen/AlphaLISA及BRET,另外1cm比色皿也可進行除吸光度檢測外的熒光強度和化學發光檢測。
  傳統酶標儀只能通過讀取光強度值這種單一數據來測定被檢測物濃度,無法給出更多信息,在細胞檢測中則會因為細胞分布不均或數量太少而影響結果準確性。為了滿足細胞類檢測對數據的更高要求,如細胞數量、生長融合度、細胞形態和增殖、凋亡水平等,具有成像功能的多功能酶標儀應運而生,讓酶標儀也能“看的見、看的清”,不僅大大豐富了傳統酶標儀的數據輸出種類,同時也提升了結果的可靠性,擴展了研究人員的工作能力,使之成為生物學和藥篩領域的得力工具之一。
  酶標儀讀數反映一個區域的光信號強度,但不關心這個區域中信號的分布和信號是來自背景或陽性染色,而成像則可以“看到”具體對象,從而提取出更確切的信息。
  普通酶標儀每個孔只有一種數據,但是具有成像功能的酶標儀還可以獲得樣品計數、樣品面積、樣品平均熒光強度、樣品總熒光強度、孔覆蓋率和感興趣蛋白表達量等種類更加豐富的數據。因此,具有成像功能的酶標儀的誕生填補了普通酶標儀與高內涵成像系統之間的空白,是一座架起酶標儀和高內涵成像系統之間的橋梁。
  成像功能硬件特點
  成像硬件部分采用LED燈作為光源,CCD作為檢測器,具有激光自動聚焦功能,其亮點在于光源并非采用傳統的垂直照射多孔板的方式,而是很有創意的采用了斜照明方式,照射角度小于90度,這樣避免了垂直照射時反射光也會垂直反射到熒光光路從而對熒光信號檢測造成強烈干擾的缺點,這種特殊的光路設計可使反射光從另一個方向反射出去,獲得的熒光信號有更高的信噪比,且大大提升了對弱熒光的檢測靈敏度。
  酶標儀成像功能的應用
  1、透射光通道下的無標記細胞識別和計數
  基于細胞成像的分析技術一般需要使用熒光染料進行標記,一些熒光標記可能對活細胞具有毒性或者只能用于固定過的細胞進行染色。無標記細胞分析技術使得研究者既無需耗時耗力的染色流程也無需擔心染料對正常細胞活力的影響,就可以計算出細胞數目和細胞匯合度,**時間獲得量化的細胞增殖及健康情況的數據。
  無標記細胞分析技術進行細胞計數:將 CHO 細胞按照 8000/孔至 250/孔的密度鋪在 384 孔板中并培養過夜。第二天,使用細胞成像系統的透射光 (TL) 通道進行成像。為了更好的比較無標記細胞計數和熒光標記細胞計數兩種方法的效果,相同細胞被固定后用綠色全細胞染料或紅色核染料進行染色,然后使用相應的熒光通道 ( 541 nm 和713 nm )進行成像。
  無標記分析技術使用的是透射光通道成像后對細胞數目進行計算。
  總結:無標記分析技術作為一種可進行細胞計數和監測細胞生長狀態的新方法,可大大節約了試驗的時間和昂貴的染料。無需固定細胞和染色意味著生長中的活細胞也能在任何時間被分析檢測,并且不干擾細胞之后的正常生長,方便進行后續分析檢測。
  2、DAPI染色替代方案:活細胞成像計數
  DAPI是一種常用于多種成像實驗,如熒光顯微成像,染色體擴散,FACS和一些細胞檢測中細胞核DNA的染色標記。然而,檢測過程中UV的激發會誘發DAPI光轉化并影響FITC/GFP通道的檢測,導致錯誤的結果解析。而且,為了獲得*佳的染色結果,DAPI染色還需要進行細胞固定。針對這些不足,本次應用提供了一些DAPI 染色的替代方案,包括完全無需細胞染色的,可以用于活細胞染色的無標記技術。
  對于細胞計數,StainFree技術和活細胞紅色染料可以達到和DAPI細胞計數一樣的效果, 但是D A P I 需要在染色之前固定。StainFree的優勢就是*大程度保留細胞活力,并且盡可能減少操作時間,因為StainFree既不涉及熒光染料,也不涉及固定。對于需要核染的情況,如監測核大小或著色水平,活細胞紅色染料可用于替代DAPI,但不需要固定。它跟DAPI一樣也不會干擾綠色熒光成像,而DAPI已經被證明過了。StainFree技術或活細胞紅色染料更適用于基于活細胞的實驗,并且能夠更好地證明實驗結果。
  3、無標記細胞增殖和形態評價
  越來越多的化合物因為人類活動而被釋放到環境當中,有許多對野生生物和人類具有潛在的長期負面影響。在20世紀,有幾千種化合物被注冊到歐盟市場,在這些化合物的生產和使用中有一些被釋放到了環境當中。近些年,大家都致力于在化合物毒性方面開發新的方法以快速篩選各種化合物。在體外毒性測試中,經常會用終點法檢測對細胞增殖的抑制,但也會有兩大局限:
  (1)一些毒性實驗如MTT,是基于特異酶的活性,而一些化合物會影響酶活卻并不產生細胞毒性;
  (2)數據種類單一,不足以提供更多證明化合物有害的指標。
  高內涵篩選(HCS)是目前*新的全自動成像和定量分析方式,提高數據輸出的通量及種類,是目前發現新化合物和評價其作用更為有效的手段。
  4、熒光蛋白表達
  GFP的轉染優化
  熒光蛋白表達,例如綠色熒光蛋白(GFP),其讀數通常用于報告基因檢測。在一個典型的報告基因檢測中,報告基因連接在感興趣的基因調控序列上,能夠十分容易的對其進行檢測和測量。帶有GFP報告基因的感興趣基因,其活性的增強會導致細胞中熒光蛋白表達的增加,這一過程可在熒光微孔板讀板機或細胞成像計數儀上測定。實行報告基因檢測的**步是轉染,將DNA誘導進真核細胞中。
  為了得到*佳效果,轉染過程必須**通過測試不同轉染條件來進行優化。優化過程可能涉及嘗試不同的轉染試劑,不同的DNA轉染量和不同的DNA與轉染試劑用量比例。細胞密度同樣重要,所以*好可以測試不同細胞密度下的轉染。不同轉染條件下的相對效果可以在熒光微孔板讀板機或細胞成像計數儀上進行監測。
  5、細胞活性/凋亡/毒性檢測
  細胞活性、凋亡和毒性檢測通常用于以下幾個方面:
  (1)細胞生物學基礎研究,涉及各種水平的調控、表達、信號傳遞與細胞活性的關系等;
  (2)疾病機制及治療藥物研究,例如檢測抗腫瘤藥物對腫瘤細胞生長的效用;
  (3)藥物毒理和安全評價,例如藥物對細胞毒性的劑量測定;
  (4)環境毒理學,例如環境污染物對細胞生長的毒害檢測;
  (5)食品農業方向,例如檢測食品中農藥殘留對細胞活性的影響。
  常規的檢測方法有以下幾種:
  (1)根據活細胞中的酶活性,如MTT、XTT、WST-1、CCK8的顯色反應;
  (2)根據活細胞中的ATP含量,如ATP含量越高,luciferase螢光素酶與底物反應越強,發光越強;
  (3)根據活細胞膜的完整性/通透性,如活細胞的完整細胞膜可以阻擋熒光染料分子的滲透,死細胞的細胞膜通透性增強而可被滲透,一些DNA染料即可分別標記活細胞與死細胞。

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