1. 項(xiàng)目背景

1.1 任務(wù)來源

近年來，土壤環(huán)境中抗生素的污染問題受到研究人員、政府部門和大眾的廣泛關(guān)注。廣東省政府對土壤中抗生素的污染非常重視，為配合貫徹《廣東省土壤污染防治行動(dòng)計(jì)劃實(shí)施方案》，規(guī)范土壤環(huán)境中抗生素的檢測方法，特制定本標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)《廣東省市場監(jiān)督管理局關(guān)于批準(zhǔn)下達(dá)省地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃項(xiàng)目的通告》，廣東省環(huán)境監(jiān)測中心、華南師范大學(xué)環(huán)境研究院負(fù)責(zé)起草《土壤 抗生素類化合物的測定 超聲提取-固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》。

1.2 工作過程

1.2.1 成立標(biāo)準(zhǔn)編制工作小組

根據(jù) 2019 年 1 月 7 日發(fā)布的《廣東省市場監(jiān)督管理局關(guān)于批準(zhǔn)下達(dá)省地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃項(xiàng)目的通告》，廣東省環(huán)境監(jiān)測中心和華南師范大學(xué)環(huán)境研究院接到制定《土壤 抗生素類化合物的測定 超聲提取-固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》的任務(wù)后，成立標(biāo)準(zhǔn)編制工作小組，由從事多年抗生素研究經(jīng)驗(yàn)、熟悉樣品前處理、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的技術(shù)人員承擔(dān)本工作。

1.2.2 查詢相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)資料

2019 年 1 月，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組根據(jù)有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制修訂工作管理辦法的相關(guān)規(guī)定， 檢索、查詢和收集相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)資料。調(diào)研發(fā)現(xiàn)，抗生素的檢測方法有微生物法、酶聯(lián)免疫吸附法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)法、液相色譜法、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等。微生物法和酶聯(lián)免疫吸附法等檢測技術(shù)存在費(fèi)時(shí)、抗體制備不易、敏感性差、假陽性率高等缺點(diǎn)；氣相色譜法和毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)則受限于抗生素的非揮發(fā)或熱不穩(wěn)定性以及不同環(huán)境中電荷性質(zhì)的差異性等而不適宜于抗生素的大量檢測。近來越來越多的文獻(xiàn)研究結(jié)果表明，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是一種高效、準(zhǔn)確和靈敏的抗生素檢測方法。但是，目前國內(nèi)暫無采用 LC-MS/MS 測定土壤環(huán)境中抗生素的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 確定標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)路線，制訂原則

2019 年 1 月至 3 月，確定了本標(biāo)準(zhǔn)的具體內(nèi)容、原則、技術(shù)路線等內(nèi)容。根據(jù)我國抗生素的使用量、土壤中常見抗生素的檢出情況等資料，確定了我國常用的 17 種抗生素為目標(biāo)物質(zhì)，包括 6 種磺胺類、2 種氟喹諾酮類、5 種大環(huán)內(nèi)酯類、2 種四環(huán)素類、林可霉素和甲氧芐氨嘧啶，采用超聲輔助提取-固相萃取柱凈化-LC-MS/MS 法分析的技術(shù)方案，實(shí)現(xiàn)對不同性質(zhì)土壤中痕量抗生素的高效、準(zhǔn)確測定。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部方法開發(fā)

2019 年 4 月至 9 月，標(biāo)準(zhǔn)編制組采用超聲輔助提取-固相萃取柱凈化-LC-MS/MS 分析的方法，在華南師范大學(xué)環(huán)境研究院廣東省化學(xué)品污染與環(huán)境安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部開展了檢出限、精密度、準(zhǔn)確度、方法適用性等系列的方法開發(fā)工作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)土壤干重為 2.0 g，經(jīng)提取、凈化和濃縮后定容體積為 1.0 ml，進(jìn)樣體積

為 10μl 時(shí)，17 種抗生素的方法檢出限為 0.6μg/kg～ 4.7μg/kg，測定下限為 2.4μg/kg ～19 μg/kg。可實(shí)現(xiàn)土壤中痕量抗生素的定量分析。

1.2.5 編寫標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說明初稿

2019 年 10 月至 12 月，標(biāo)準(zhǔn)編制工作小組匯整前期研究成果，編寫標(biāo)準(zhǔn)草案及編制說明。

1.2.6 開展方法驗(yàn)證工作

2020 年 5 月至 8 月，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組確定了外部 6 家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法驗(yàn)證，于2020 年 9 月收回全部的驗(yàn)證報(bào)告，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了數(shù)據(jù)的匯總和分析整理工作， 并編寫完成了驗(yàn)證匯總報(bào)告。

1.2.7 編寫標(biāo)準(zhǔn)文本（征求意見稿）和編制說明

2020 年 9 月至 11 月，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組編寫《土壤 抗生素類化合物的測定 超聲提取-固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（討論稿）》的標(biāo)準(zhǔn)文本及編制說明， 并于 2020 年 11 月 3 日組織專家對標(biāo)準(zhǔn)文本（討論稿）及編制說明進(jìn)行了初步論證。根據(jù)專家意見進(jìn)一步修改，形成標(biāo)準(zhǔn)文本（征求意見稿）及編制說明。

2 標(biāo)準(zhǔn)制修訂的必要性

2.1 目標(biāo)污染物的環(huán)境危害

2.1.1 目標(biāo)污染物的基本性質(zhì)

抗生素是由微生物 在生長代謝過程中產(chǎn)生或由人工合成或半合成的，能抑制微生物生長的小分子化合物。由于抗生素在人類臨床疾病治療和畜牧水產(chǎn)業(yè)中的廣泛應(yīng)用，自 1929 年英國科學(xué)家弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素以來，隨著科技的進(jìn)步，不斷有新的抗生素被發(fā)現(xiàn)或合成，抗生素隊(duì)伍得以不斷壯大，至今已達(dá)上萬種，不僅包括微生物產(chǎn)生的，也包括高等動(dòng)植物產(chǎn)生的代謝物以及用化學(xué)方法合成和半合成的化合物；不僅包括抗細(xì)菌的物質(zhì)，也包括抗腫瘤、抗原蟲、抗病毒、抗真菌、抗藻類、抗寄生蟲等的物質(zhì)。

目前常見的抗生素類型主要有：

磺胺類：磺胺類藥物是應(yīng)用早的一類人工合成抗菌藥物。磺胺類藥物屬于 廣譜抗菌藥物，因其抗菌譜廣、療效強(qiáng)、方便安全等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于人體和動(dòng)物 。常見的磺胺類藥物主要有磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、復(fù)方新諾明 等。磺胺的分子中含有一個(gè)苯環(huán)，一個(gè)對位氨基和一個(gè)磺酰胺基。磺胺類化學(xué)物主要是 通過各種化學(xué)基團(tuán)來取代磺酰胺基上的氫原子制備的有效衍生物。

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??圖 1 主要的抗生素種?

類 四環(huán)素類：四環(huán)素是一類被廣泛使用的廣譜抗生素，能通過與核糖體 30S 亞基結(jié)合，阻止氨酰-tRNA 與核糖體結(jié)合而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。四環(huán)素類抗生素可與 Ca2+、Mg2+、Fe2+和 Al3+等金屬離子形成絡(luò)合物，影響藥效。同時(shí)與 Ca2+形成的不溶絡(luò)合物會(huì)影響小兒的牙齒變黃和骨骼發(fā)育，因此小孩和孕婦禁用四環(huán)素類抗生素。常見的四環(huán)素類抗生素有金霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素、甲烯土霉素、甘氨酰環(huán)素等。目前，四環(huán)素類抗生素多用于養(yǎng)殖業(yè)，如養(yǎng)豬、養(yǎng)雞和水產(chǎn)養(yǎng)殖等。

喹諾酮類：喹諾酮類藥物是一類 4-氧-1,4-二氫喹諾酮為原始骨架的人工合成抗生素。喹諾酮類藥物通過在 DNA 解鏈階段俘獲細(xì)菌型 IIA 拓?fù)洚悩?gòu)酶、DNA 旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶 IV 而對染色體拓?fù)洚悩?gòu)化產(chǎn)生干擾，阻滯 DNA 單鏈部分的復(fù)性，從而抑制細(xì)菌 DNA 的復(fù)制而發(fā)揮抑菌作用。自 20 世紀(jì) 60 年代萘啶酸、吡咯酸、惡喹酸等的發(fā)現(xiàn)開始，喹諾酮藥物已發(fā)展至第四代，抗菌活性逐漸增強(qiáng)，副作用降低。現(xiàn)已被廣泛用于人畜疾病治療，常用的主要為第三代喹諾酮類，如環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾氟沙星和培氟沙星等。該類物質(zhì)相對較穩(wěn)定，水溶性偏低。

β-內(nèi)酰胺類：β-內(nèi)酰胺類是一類含有β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素，其通過抑制革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁合成的后一步而對細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用。該類抗生素具有殺菌活性強(qiáng)、藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)良好、低宿主毒性以及與其它種類抗生素 協(xié)同增效等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)運(yùn)于臨床和畜牧業(yè)中。青霉素類水溶液不穩(wěn)定， *易失效；不耐熱；酸、堿、重金屬及青霉素酶可使其β-內(nèi)酰胺環(huán)破裂，導(dǎo)致失效。常用的有青霉素、苯唑西林、氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢噻肟等。

大環(huán)內(nèi)酯類：大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是一類具有大環(huán)內(nèi)脂結(jié)構(gòu)，可抑制大多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的廣譜一線抗生素。大環(huán)內(nèi)酯類通過與細(xì)菌核糖體 50S 亞基可逆性結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的合成，發(fā)揮抑菌活性。常見的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素有紅霉素 A、阿奇霉素、泰樂菌素、竹桃霉素和北里霉素。

多肽類：多肽類抗生素是一類具多肽結(jié)構(gòu)特征的抗生素，通過作用于細(xì)菌的滲透壓屏障，損傷細(xì)胞質(zhì)膜而對細(xì)菌產(chǎn)生抑制，可分為多黏菌素類、糖肽類和桿菌肽類。通常被用作抵抗革蘭氏陽性菌的后一道防線。常見的多肽類抗生素有多黏菌素 B、桿菌肽、短桿菌肽、萬古霉素、替考拉寧、奧利萬星、達(dá)巴萬星、特拉萬星、氯依瑞霉素等。

林可酰胺類：林可酰胺類化學(xué)結(jié)構(gòu)主要由氨基酸和寡糖構(gòu)成，其主要作用機(jī)制為與核糖體 50S 亞基結(jié)合抑制肽鏈的生成，主要針對厭氧細(xì)菌和原生動(dòng)物感染。易引發(fā)惡心、嘔吐、腹瀉、皮疹、發(fā)燒等不良反應(yīng)，很少用于臨床醫(yī)療，主要與大觀霉素聯(lián)合用于反芻動(dòng)物、豬和禽類。該類抗生素中的細(xì)菌自然代謝生成的代表有林可霉素和天青霉素，其半合成的代表有克林霉素和吡利霉素。

氯霉素類：氯霉素是一種對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的廣譜抗生素， 氯霉素主要抑菌機(jī)理為通過與原核細(xì)胞中 50S 核糖體亞基結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的合成而阻止細(xì)菌繁殖。氯霉素分子主要由對硝基苯基、丙二醇與二氯乙酰胺三個(gè)部分組 成，性質(zhì)穩(wěn)定。氯霉素類能引發(fā)多種嚴(yán)重的副作用，例如骨髓抑制、再生性障礙貧血、血小板減少癥和粒細(xì)胞減少等，故中國、日本、加拿大、美國和澳大利亞等國 家現(xiàn)已明令禁止其使用。常見的氯霉素類抗生素有氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考等。

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