1 范圍

本文件規定了土壤中17種抗生素類化合物的超聲提取-固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜測定方法。

本文件適用于土壤中磺胺氯噠嗪、磺胺甲基嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺吡啶、克拉霉素、脫水紅霉素、北里霉素、羅紅霉素、泰樂菌素、金霉素、土霉素、環丙沙星、諾氟沙星、甲氧芐氨嘧啶和林可霉素17種抗生素（見附錄A）的定性和定量檢測。

當土壤干重為2.0 g，經提取、凈化和濃縮全過程處理后，定容體積為1.0 ml，進樣體積為10μl時，17種抗生素的方法檢出限為0.9g/kg～4.7g/kg，測定下限為3.6μg/kg～19μg/kg。詳見附錄B。

2 規范性引用文件

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HJ 613 土壤 干物質含量和水分的測定 重量法

HJ/T 166 土壤環境監測技術規范

3 術語與定義

本文件沒有需要界定的術語和定義。

4 方法和原理

過篩土壤以乙腈-McIlvaine緩沖液為提取劑，采用超聲波輔助提取目標抗生素。提取液經固相萃取柱富集、凈化、定容后，采用高效液相色譜-三重四*桿質譜檢測。根據目標物的保留時間、特征離子對及其豐度定性，采用內標法定量。

5 干擾和消除

四環素類抗生素可與土壤中的金屬離子結合形成絡合物，干擾提取過程，降低此類化合物的提取效率。在提取過程中，加入金屬離子螯合劑乙二胺四乙酸四鈉，可抑制金屬離子的干擾。

6 試劑和材料

6.1 實驗用水為新制備不含目標化合物的純水。

6.2 硫酸：ρ = 1.84 g/ml，分析純。

6.3 氫氧化鈉（NaOH）：分析純。

6.4 甲醇（CH3OH）：色譜純。

6.5 乙腈（CH3CN）：色譜純。

6.6 甲酸（HCOOH）：色譜純。

6.7 乙酸銨（CH3COONH4）：色譜純。

6.8 磷酸氫二鈉十二水化合物（Na2HPO4·12H2O）：分析純。

6.9 檸檬酸一水化合物（C6H8O7·H2O）：分析純。

6.10乙二胺四乙酸四鈉（Na4EDTA）：分析純。

6.11硫酸溶液：c = 4.0 mol/L。量取 22 ml 硫酸（6.2），緩慢加入到純水中，待溫度降至室溫后，用純水定容到 100 ml。室溫下保存期為 3 個月。

6.12NaOH 溶液（1.0 mol/L）：稱取 4 g 氫氧化鈉（6.3）溶于純水中，定容至 100 ml。室溫下保存期為 2 個月。

6.13氫氧化鈉的甲醇溶液：量取 1.0 ml 1.0 mol/L 的氫氧化鈉溶液（6.12）溶于甲醇（6.4）中，定容至 200 ml。臨用現配。

6.14甲酸-乙酸銨的水溶液：量取 1.5 ml 甲酸（5.5）并稱取 0.116 g 乙酸銨（6.7），溶于 750 ml 純水中，制備成 0.2%（V/V）甲酸-2.0 mmol/L 乙酸銨的水溶液。臨用現配。

6.15甲酸-乙酸銨-乙腈的混合液：分別量取 90 ml 甲酸-乙酸銨的水溶液（6.14）和 10 ml 乙腈（6.5）， 混合并搖勻。臨用現配。

6.16磷酸氫二鈉溶液（0.2 mol/L）：稱取 71.628 g 磷酸氫二鈉十二水化合物（6.8）溶于純水中，定容至 1000 ml。室溫下保存期為 3 個月。

6.17檸檬酸溶液（0.1 mol/L）：稱取 21.014 g 檸檬酸一水化合物（6.9）溶于純水中，定容至 1000 ml。室溫下保存期為 3 個月。

6.18McIlvaine 緩沖液（pH = 4）：分別量取 380 ml 磷酸氫二鈉溶液（6.16）和 620 ml 檸檬酸溶液（6.17），混合并搖勻。室溫下保存期為 3 個月。

6.19乙腈-McIlvaine 緩沖液的混合液（1: 1，V/V）：分別量取 10 ml 乙腈（6.5）和 90 ml McIlvaine緩沖液（6.18），混合并搖勻。臨用現配。

6.20石英砂：粒徑 150 ～ 250μm（100 ～ 60 目）。使用前置于馬弗爐中 450℃烘烤 4 h，冷卻后裝入磨口玻璃瓶中密封，于干燥器中保存。

6.21抗生素標準儲備液：ρ＝100 mg/L（參考濃度）

17種抗生素單標可直接購買市售有證標準溶液，也可用標準物質（純度≥ 98%）制備。

使用標準物質制備標準儲備液的參考方法：準確稱取10.0 mg抗生素標準物質，溶于100 ml甲醇（6.4） 中，終濃度為100 mg/L；對于喹諾酮類抗生素，則溶于100 ml氫氧化鈉的甲醇溶液（6.13）中。儲備液應在-18 °C以下避光保存3個月或參照制造商的產品說明。使用時應恢復至室溫，并搖勻。

6.22 抗生素標準使用液：ρ＝1.0 mg/L（參考濃度）

將17種抗生素標準儲備液（6.21）按需要用甲醇（6.4）稀釋。標準使用液在?18℃以下避光保存3個月。使用時應恢復至室溫，并搖勻。

6.23 內標物儲備液：ρ＝100 mg/L（參考濃度）

8種抗生素內標物為環丙沙星-d8、脫水紅霉素-13C-d3、林可霉素-d3、磺胺甲嘧啶-d4、磺胺二甲嘧啶-13C6、磺胺甲噁唑-d4、噻苯咪唑-d4、甲氧芐氨嘧啶-d3。可直接購買市售有證標準溶液，也可用標準物質（純度≥ 95%）制備。儲備液應在–18 °C以下避光保存3個月或參照制造商的產品說明。使用時應恢復至室溫，并搖勻。每種抗生素對應的內標物詳見附錄A。其它符合內標物性質的化合物也能夠使用。

6.24 內標物使用液：ρ＝1.0 mg/L（參考濃度）

取8種內標物儲備液（6.23）按需要用甲醇（6.4）稀釋。內標物使用液在?18 ℃以下避光保存3個月。使用時應恢復至室溫，并搖勻。

6.25 離子交換柱：填料為高純硅膠基質上鍵合三甲基氨丙基的強陰離子交換吸附劑或其他等效 離子交換柱，參考規格為 500 mg/6 ml。

6.26 固相萃取柱：填料為二乙烯苯和 N-乙烯基吡咯烷酮共聚物（HLB）或其他等效固相萃取柱，參考規格為 200 mg/6 ml。

6.27 氮氣：純度≥ 99.99%。

6.28 濾膜：0.22 μm 尼龍濾膜。

7 儀器和設備

7.1 棕色玻璃瓶：具塞磨口，250 ml。

7.2 冷凍干燥機。

7.3 球磨機：配瑪瑙球磨罐和不同尺寸的瑪瑙球。

7.4 超聲波裝置：水槽式，超聲波輸出功率不小于 500 W，超聲時間可調節。

7.5 離心機：4000 r/min 或以上。

7.6 固相萃取裝置：流速可調節。

7.7 濃縮裝置：氮吹濃縮儀或性能相當的設備。

7.8 高效液相色譜-三重四*桿質譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）。

7.9 色譜柱：C18或等效反相高效液相色譜柱，參考規格為 100 mm（長度）× 2.1 mm ，1.8 μm 。

7.10 一般實驗室常用儀器和設備。

8 樣品

8.1 樣品的采集與保存

按照HJ/T 166的相關規定進行土壤樣品的采集和保存。

樣品應保存在潔凈的棕色玻璃瓶（7.1）中，運輸過程中應避光冷藏。運回實驗室后，在0～4 ℃避光保存，并于一周內完成樣品前處理。

8.2 試樣制備

8.2.1 樣品預處理

將新鮮土壤置于不銹鋼或聚四氟乙烯盤中，除去樹枝、葉子和石子等異物，混勻。取適量的混勻土 樣，放入冷凍干燥機（7.2）中脫水。凍干后的樣品用球磨機（7.3）或瑪瑙研缽研磨充分后，過60目（孔 徑0.25 mm）標準土壤篩，待提取。

8.2.2 提取

稱取2 g（精確到0.01 g）預處理后的土樣（8.2.1）于50 ml聚丙烯離心管中，加入100l內標物使用液（6.24），混勻，于0～4 ℃避光保存12 h，待甲醇揮發。加入0.5 g乙二胺四乙酸四鈉（6.10）和20 ml 乙腈-McIlvaine緩沖液的混合液（6.19），渦旋震蕩20 s，再置于超聲波中15 min，4000 r/min室溫下離心10 min，收集上清液。

重復提取一次，合并兩次提取液，待后續處理。

8.2.3 凈化

以1000 ml純水稀釋提取液（8.2.2），并用4 mol/L硫酸（6.11）調節pH值至3左右。

將SAX陰離子交換柱（6.25）與HLB固相萃取柱（6.26）首尾串聯，固定在固相萃取裝置（7.6）上。依次用10 ml甲醇（6.4）和10 ml純水（6.1）活化萃取柱，保證柱頭浸潤。提取液以5～10 ml/min的流速通過小柱。待提取液全部通過小柱后，拆下SAX柱，用10 ml純水淋洗HLB柱，去除小柱上的乙二胺四乙酸四鈉（6.10）。真空抽濾使HLB柱干燥。用5 ml甲醇（6.4）以約0.5 ml/min的流速洗脫兩次，收集全部洗脫液。

注：固相萃取凈化過程中宜用錫箔紙包裹固相萃取柱避光。

8.2.4 濃縮定容

洗脫液（8.2.3）采用氮氣（6.27）在40 °C下緩慢吹至近干，用甲酸-乙酸銨-乙腈的混合液（6.15） 定容至1.0 ml，尼龍濾膜（6.28）過濾后，待測。

8.3 空白試樣

以石英砂（6.20）代替實際樣品，按照與試樣制備（8.2）相同操作步驟，制備空白試樣。

8.4 干物質含量測定

另稱取一份冷凍干燥后的樣品進行干物質含量的測定，具體要求按照HJ 613執行。

9 分析步驟

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