1 適用范圍

本標準規(guī)定了測定水質(zhì)急性毒性的斑馬魚卵法。

本標準適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水的急性毒性測定。

2 規(guī)范性引用文件

本標準內(nèi)容引用了下列文件中的條款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本適用于本標準。

GB/T 6920 水質(zhì) pH 值的測定玻璃電*法

GB/T 13267 水質(zhì) 物質(zhì)對淡水魚（斑馬魚）急性毒性測定方法

HJ 91.1 污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

HJ 506 水質(zhì) 溶解氧的測定 電化學探頭法

HJ/T 91 地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

HJ/T 164 地下水環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

3 術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標準。

3.1

魚卵 fish egg

指處于卵膜破裂前整個發(fā)育階段的卵細胞，斑馬魚卵相關(guān)發(fā)育階段參見附錄 A。

3.2

稀釋倍數(shù) dilution level

原水樣占稀釋后水樣總體積分數(shù)的倒數(shù)，一般用 D 來表示。例如，水樣未稀釋，則稀釋倍數(shù) D=1；取 250 ml 水樣稀釋至 1000 ml（即體積分數(shù)為 25%），則稀釋倍數(shù)D=4。

3.3

低無效應稀釋倍數(shù) lowest ineffective dilution

測試中不產(chǎn)生測試效應的低稀釋倍數(shù)，本標準指不少于 90%魚卵存活時水樣的低稀釋倍數(shù)，用 LID 表示。

3.4

半數(shù)效應濃度 EC50

指暴露48 h 后使50%斑馬魚卵產(chǎn)生效應的原水樣占稀釋后水樣總體積的百分數(shù)，用EC50表示。本標準中 EC50即半數(shù)致死濃度 LC50。

3.5

參比物質(zhì) reference substance

測試中，用于驗證方法敏感性的已知陽性對照物質(zhì)，如本標準中 3,4-二氯苯胺。

4 方法原理

使用多孔細胞培養(yǎng)板，在微孔板對照、陰性對照和陽性對照控制的條件下，將 4-細胞期～128-細胞期的斑馬魚受精卵置于不同稀釋倍數(shù)的水樣中，在 26℃±1℃的條件下培養(yǎng) 48 h，根據(jù)魚卵存活與死亡的統(tǒng)計數(shù)據(jù)計算 LID 或 EC50 值，表征水樣的急性毒性。

5 干擾和消除

水樣濁度或色度干擾測試終點判斷，可用塑料滴管（7.11）緩慢從多孔細胞培養(yǎng)板（7.8） 中吸出一定量的水樣后再行觀測，避免觸碰魚卵；觀測結(jié)束后，若需繼續(xù)暴露，則用塑料滴管（7.11）將原水樣移回，恢復原有暴露體積。

6 試劑和材料

6.1 受試生物

6.1.1 種魚

使用健壯、無疾病、無畸形、產(chǎn)卵量及受精率高的野生型斑馬魚作為種魚用于產(chǎn)卵。成魚體長 3.5 cm 左右，魚齡在 6 月～24 月之間。健康雌魚腹部銀亮，飽滿膨大。健康雄魚體型修長，腹部扁平，身體帶有金黃色光澤。種魚在產(chǎn)卵前 6 個月不予使用任何藥物。種魚馴養(yǎng)及維持具體條件見附錄 B。

6.1.2 魚卵

確保試驗魚卵受精率≥70%，處于 4-細胞期～128-細胞期（見附錄 A）。

6.2 試劑

除非另有說明，分析時使用符合國家標準的分析純試劑。試驗用水使用新制蒸餾水或去離子水，滿足 pH 值 6.5～8.5，電導率＜10 μS/cm 的要求。

6.2.1 氫氧化鈉（NaOH）。

6.2.2 氯化鈣（CaCl2·2H2O）。

6.2.3 硫酸鎂（MgSO4·7H2O）。

6.2.4 碳酸氫鈉。

6.2.5 氯化鉀（KCl）。

6.2.6 3,4-二氯苯胺（C6H5Cl2N），優(yōu)級純。

6.2.7 鹽酸：ρ（HCl）=1.19 g/ml。

6.2.8 鹽酸溶液：c（HCl）=0.1 mol/L。

量取 8.3 ml 鹽酸（6.2.7），用水定容至 1 000 ml。

6.2.9 氫氧化鈉溶液：c（NaOH）=0.1 mol/L。

稱取 4 g 氫氧化鈉（6.2.1），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml。

6.2.10 參比物質(zhì) 3,4-二氯苯胺儲備液：ρ（C6H5Cl2N）=100 mg/L。

稱取 0.05 g 3,4-二氯苯胺（6.2.6），溶于少量標準稀釋水（6.2.16）中，用標準稀釋水（6.2.16）定容至 500 ml，靜置 24 h，調(diào)節(jié) pH 值至 7.0。避光冷藏保存，儲備液可儲存 6 個月。

6.2.11 參比物質(zhì) 3,4-二氯苯胺工作液：ρ（C6H5Cl2N）=3.7 mg/L。

量取 3.7 ml 參比物質(zhì) 3,4-二氯苯胺儲備液（6.2.10），用溶解氧濃度達空氣飽和值的標準稀釋水（6.2.16）定容至 100 ml，使用前按 8.2.1 步驟平衡至 26℃±1℃。該溶液作為陽性對照，臨用前現(xiàn)配。

6.2.12 氯化鈣儲備液：ρ（CaCl2·2H2O）=11.76 g/L。

稱取 11.76 g 氯化鈣（6.2.2），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml?？蓛Υ?6 個月。

6.2.13 硫酸鎂儲備液：ρ（MgSO4·7H2O）=4.93 g/L。

稱取 4.93 g 硫酸鎂（6.2.3），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml?？蓛Υ?6 個月。

6.2.14 碳酸氫鈉儲備液：ρ（NaHCO3）=2.52 g/L。

稱取 2.52 g 碳酸氫鈉（6.2.4），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml。可儲存 6 個月。

6.2.15 氯化鉀儲備液：ρ（KCl）=0.22 g/L。

稱取 0.22 g 氯化鉀（6.2.5），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml?？蓛Υ?6 個月。

6.2.16 標準稀釋水。

將氯化鈣儲備液（6.2.12）、硫酸鎂儲備液（6.2.13）、碳酸氫鈉儲備液（6.2.14）和氯化鉀儲備液（6.2.15）四種儲備液各 25 ml 混合，用水定容至 1 000 ml。

7 儀器和設(shè)備

7.1 冷藏采樣箱：2℃～8℃；

7.2 pH 計：測量范圍 0～14，小分度為 0.1 pH 單位；

7.3 溶解氧測定儀：測量范圍 0 mg/L～20 mg/L，小分度為 0.1 mg/L；

7.4 倒置顯微鏡或體視顯微鏡：小放大倍數(shù)為 30×；

7.5 冰箱：冷藏室 2℃～8℃；冷凍室≤-18℃；

7.6 恒溫培養(yǎng)箱或恒溫室：溫度可調(diào)至 26℃±1℃；

7.7 斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)：包括凈水、儲水、供水、水質(zhì)控制及循環(huán)等系統(tǒng)；

7.8 多孔細胞培養(yǎng)板：每孔容積 2.5 ml～5 ml 或采用其它相同功能的細胞培養(yǎng)板，可選擇市售；

7.9 產(chǎn)卵盒：惰性材料，推薦尺寸：20 cm×10 cm×11 cm（參見附錄 C），可選擇市售；

7.10 溫度計：0℃～50℃；

7.11 塑料滴管：5 ml，口徑大于 3 mm；

7.12 一般實驗室常用器皿和設(shè)備。

8 樣品

8.1 樣品的采集和保存

根據(jù)樣品性質(zhì)及監(jiān)測需要使用 1 000 ml 及以上容量的棕色玻璃瓶（或聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乙烯材質(zhì)的容器）按照HJ 91.1、HJ/T 91 或 HJ/T 164 的要求進行水樣的采集，水樣沿瓶內(nèi)壁緩慢倒入，并與瓶塞間不留空隙。

水樣采集后，立即于 2℃～8℃避光運輸和保存，并盡快進行試驗，保存時間長不超過 48 h。水樣若需長期保存，則上述水樣采集后應盡快送回實驗室冷凍（≤-18℃）保存， 保存前將水樣充分混勻后按每 1000 ml 容器盛裝 500 ml～700 ml 水樣的量分裝，保存期不超過 2 個月。

8.2 樣品預處理

8.2.1 溫度

冷凍保存的水樣需在不超過 25℃水浴輕微振蕩解凍，或在 2℃～8℃冷藏過夜解凍。受試水樣在試驗開始前，放置于恒溫培養(yǎng)箱或恒溫室（7.6）中，26℃±1℃避光平衡至恒溫后用于試驗。

8.2.2 pH 值

按照 GB/T 6920 方法測定水樣 pH 值。當 pH 值＜6.5 或 pH 值＞8.5 時，使用鹽酸溶液（6.2.8）或氫氧化鈉溶液（6.2.9）調(diào)節(jié)水樣 pH 值至 6.5～8.5，盡量減少酸堿調(diào)節(jié)液的用量， 以減少對水樣濃度的影響。測定并記錄調(diào)節(jié)后的水樣 pH 值，按后續(xù)步驟進行水樣測定。

當 pH 值的影響需要反映在試驗結(jié)果中或者調(diào)節(jié) pH 值會引起水樣物理變性或化學反應時，則不調(diào)節(jié)水樣 pH 值。

根據(jù)水樣測定的實際需求，也可對 pH 值調(diào)節(jié)前后的水樣同時開展試驗比較。

8.2.3 溶解氧

按照 HJ 506 方法測定水樣溶解氧濃度，確保用于暴露試驗（9.3）步驟中的每個稀釋水樣中初始溶解氧濃度不低于 4 mg/L（大約 50%飽和度）。若要充氧，溶解氧濃度不超過相應飽和溶解氧值。

8.3 樣品稀釋

8.3.1 預實驗

當濃度難以預估時需進行預試驗，以稀釋比為 10 選擇 3 個連續(xù)濃度的稀釋水樣，每一濃度以 5 粒魚卵按 9.3～9.6 部分進行試驗，以確定魚卵死亡率 ****～0%與稀釋水樣濃度大致對應的范圍。