檢測及試驗方法

　　樣品處理

　　液體樣品

　　稱取液體樣品10 mL于100 mL離心管中，加入0.2 mL甲酸，渦旋混勻1分鐘后，超聲提取10分鐘，離心，經0.45μm濾膜過濾，取5 mL上已活化的Oasis WAX柱，依次以10 mL 2%甲酸淋洗，5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，氮吹濃縮到1 mL進樣。

　　固體樣品

　　稱取固體樣品2 g于100 mL離心管中，加入25 mL乙醇:氨水:水(9:0.5:0.5)混合溶劑勻漿，渦旋1分鐘后超聲提取30分鐘，離心，殘渣重復提取2次，合并提取液旋蒸定容10mL，經0.45μm濾膜過濾，取5 mL上已活化的Oasis WAX柱，依次以10mL 2%甲酸淋洗，5mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，氮吹濃縮到1 mL進樣。

　　結果與分析

　　前處理的選擇

　　樣品基質復雜，而且同時檢測12種添加劑并保證準確和高的回收率，這對前處理提出了很高的要求。幾種添加劑均可溶于水因此文獻往往采用直接濾膜過濾后檢測，但對于基質復雜的樣品，*易造成系統的污染。選擇合適的前處理方法，可以去除雜質，降低基線雜質噪音。文獻中前處理的步驟往往繁瑣耗時、回收率偏低，從添加劑自身化合物性質出發，結合文獻設計了樣品前處理方法。

　　1.沉淀劑

　　部分固體樣品中含有蛋白質，如果蛋白沉淀劑選擇不當，將對后期實驗產生嚴重影響，實驗考察了乙腈、乙酸鋅-亞鐵氰化鉀去除蛋白，但這一過程中部分防腐劑、色素也被沉淀吸附，降低回收率。作者采用氨水:乙醇:水溶液進行提取。糖精鈉、苯甲酸和山梨酸在堿性條件下以鹽的形式存在，可以溶于強*性的溶劑。安賽蜜易電離，合成色素是水溶性化合物，易溶于水及*性溶液；濃度90%以上的乙醇又可以使蛋白質脫水，促進蛋白質的凝聚，同時乙醇可起到破壞沉淀膠體減少干擾的作用。通過對不同比例的氨水乙醇水溶液進行比較，*終確定實驗比例。

　　2.固相萃取柱

　　提取液可同時將糖和某些脂溶性成分提取出，影響基線穩定性并形成雜質干擾。所以選取固相萃取小柱進行凈化。

　　根據文獻試驗考察了不同分離模式的固相萃取柱，包括：反相C18-HLB固相萃取柱)和弱陰離子交換WAX柱固相萃取柱、強陰離子交換MAX固相萃取柱。

　　HLB柱以親水一親脂共聚物吸附劑為固定相，實驗發現HLB柱對安賽蜜、糖精鈉和胭脂紅、赤蘚紅回收率較低，尤其赤蘚紅僅在20%左右。所以試驗又對其他小柱進行了考察，強陰離子交換MAX無法保留糖精鈉、安賽蜜、苯甲酸、山梨酸，實驗中，糖精鈉、安賽蜜、苯甲酸、山梨酸回收率僅為35%，可能當pH為8～9時，這四種物質的分子狀態不穩定，無法保留在MAX柱上。

　　Oasis WAX屬于混合型弱陰離子交換反相吸附柱，可以有效地去除雜質干擾，提高回收率。幾種甜味劑和防腐劑同時帶有有機官能團和可離子化官能團在中性和偏酸性條件下，電離效果降低，主要以中性分子的形式存在，利用反相柱的吸附作用形成保留。而赤蘚紅為苯甲酸鈉結構，也存在一定保留，其他合成色素為苯磺酸鈉結構含有磺酸基，屬強陰離子化合物，利用弱陰離子交換作用形成保留效果。實驗發現赤蘚紅回收率偏低，可能是赤蘚紅的苯甲酸鈉結構，相對其他苯磺酸鈉結構的著色劑，保留較弱；其次甲醇及甲酸可對赤蘚紅部分洗脫，與小柱結合較弱的赤蘚紅也被部分洗脫；另外混合纖維素膜對赤蘚紅有較強吸附，常用的聚醚砜和尼龍濾膜對部分色素也有很強的吸附作用，*后采取0.45μm聚四氟乙烯濾膜過濾。

　　3.流動相的選擇

　　實驗選取純水和甲醇；乙腈-乙酸銨；甲醇-乙酸銨體系分別進行考察。發現純水和甲醇流動相無法使安賽蜜、苯甲酸和山梨酸有效分離。可能是因為中性條件下，部分甜味劑和防腐劑以陰離子的形式存在，與色譜柱的固定相之間的作用較弱，分離效果差；在弱酸性流動相中可使苯甲酸和山梨酸主要以中性分子形式存在，與固定相之間的相互作用顯著增強，分離效果得到明顯改善。試驗表明，而合成色素的分離效果受pH值影響較小。

　　乙腈-乙酸銨體系無法使部分合成色素(如胭脂紅、日落黃)有效分離，而甲醇-乙酸銨各添加劑得到有效分離、峰形*佳。進一步選用0.01 mol/L、0.02 mol/L、0.03 mol/L、0.04 mol/L進行實驗。發現在0.02 mol/L時各種添加劑的峰形和分離效果達到*佳；當濃度再增大時，峰形和分離效果無明顯增強。這主要是因為弱酸性的中乙酸銨緩沖鹽溶液含有羧酸基團可對甜味劑和防腐劑有更強的洗脫能力，因此*終選用0.02 mol/L甲醇-乙酸銨流動相體系。

　　檢測波長的確定

　　檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、赤蘚紅、誘惑紅、亮藍、靛藍8種合成色素的化學結構中均含有苯磺酸基，有較強的紫外吸收特性。同時各種色素的化學結構中所含的發色團及助色團不同而呈現不同的顏色，在可見光區也有各自的較強的吸收。標準溶液分別用紫外光譜儀進行掃描，發現在210 nm附近處有較大吸收峰，但由于樣品中很多干擾物在此波長下都有吸收，因此優先選擇可見波長作為測定波長，經過反復試驗，*后確定為：檸檬黃428 nm、莧菜紅521 nm、日落黃483 nm、胭脂紅509 nm、亮藍630nm、靛藍608 nm、胭脂紅509 nm、誘惑紅和赤蘚紅波長530 nm。GB/T5009.35-2003**法選擇254 nm波長檢測，其他色素可以很容易的檢出，只有亮藍靈敏度很低，選擇可見光區的*大吸收波長檢測后亮藍和赤蘚紅的靈敏度明顯提高并且干擾物影響小。

　　對甜味劑和防腐劑標準溶液進行紫外掃描發現*大吸收波長分別為：安賽蜜226 nm，糖精鈉202 nm，苯甲酸224 nm，山梨酸253 nm。由于流動相在低于200 nm下有吸收，會造成噪音過高，250 nm處苯甲酸、糖精鈉靈敏度太低不能滿足檢測需要，為此選230 nm為苯甲酸、山梨酸的檢測波長。安賽蜜、糖精鈉的*大吸收波長分別在226 nm及202 nm處，本實驗選用作為檢測波長，結合文獻作者選取靈敏度相近的214nm處進行檢測。

　　干擾試驗

　　在實際樣品檢測中發現，某些食品基質中可以對安賽蜜與糖精鈉的測定造成干擾。如酒類產品中的糠醇等存在與糖精鈉接近的化學結構，保留時間與吸收光譜均類似，易造成假陽性判定。建議進行加標試驗或輔助進行光譜掃描或串聯熒光檢測器，進行驗證。

　　標準曲線及檢出限

　　將12種標準品用水配制成濃度分別為：0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的標準溶液，進樣分析，得到色譜圖，以峰面積為縱坐標，標品進樣量為橫坐標，獲得標準曲線，計算線性回歸方程及相關系數。

　　回收率的分析

　　取5種不同類型食品，分別用本方法制成樣品溶液，分別加入一定量的標準品溶液，使標品濃度分別為0.02mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.80mg/mL、0.10 mg/mL，按1.5樣品前處理方法進行處理后檢測，可以滿足檢測要求。