慢病毒( lentivirus) 載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒( human immunodeficiency virus，HIV-1) 為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。慢病毒源于逆轉(zhuǎn)錄病毒，但又有所不同，在感染能力方面比逆轉(zhuǎn)錄病毒還強(qiáng)，又很少引發(fā)免疫反應(yīng)。在基因治療中慢病毒載體具有容納外源性目的基因片段大、穩(wěn)定整合、持久表達(dá)、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究也非常深入，在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，取得了明確的臨床療效，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

近年來，由學(xué)術(shù)研究者和研發(fā)公司采用慢病毒載體成功對 T 細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作的試驗(yàn)，用于癌癥適應(yīng)證過繼治療成為研究熱點(diǎn)。FDA 于 2017 年分別批準(zhǔn)了諾華公司的 CAR-T 產(chǎn)品 Kymriah 和 Kite Pharma 公司的 Yescarta，此外，幾個研究中心正在嘗試使用慢病毒載體技術(shù)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移改造的造血干細(xì)胞和其他靶標(biāo)。因此，考慮到慢病毒載體技術(shù)的廣泛應(yīng)用，具有復(fù)制能力的慢病毒檢測逐漸成為重要問題。

由于目前載體系統(tǒng)相關(guān)的復(fù)制型慢病毒(RCL)結(jié)構(gòu)復(fù)雜性導(dǎo)致 RCL 檢測分析存在挑戰(zhàn)性，前期載體系統(tǒng)中 RCL 產(chǎn)生的主要原因是轉(zhuǎn)移載體和包裝載體同源序列的重組。隨著新的載體系統(tǒng)的發(fā)展與應(yīng)用，載體系統(tǒng)中各元件之間發(fā)生同源重組的變化導(dǎo)致 RCL 生成機(jī)制和結(jié)構(gòu)的變化愈加復(fù)雜。而且，重組不僅限于載體系統(tǒng)之間各組分發(fā)生的重組，也包括載體成分和細(xì)胞基因組之間的重組。因此，為確保慢病毒載體相關(guān)產(chǎn)品在臨床應(yīng)用中的安全性，需要考慮將 RCL 作為一項(xiàng)關(guān)鍵的控制項(xiàng)目。筆者針對目前文獻(xiàn)報(bào)道對相關(guān)檢測方法進(jìn)行簡單闡述，主要闡述內(nèi)容包括檢測方法的原理、利弊分析及前景與展望方面。

?**，這種方法的靈敏性較高。基于文獻(xiàn)報(bào)道，采用人為制造的RCL 進(jìn)行檢測( 該 RCL 可編碼 Gag，Pol，Tat，Rev 基因以及 Env 和 VSV-G 包膜基因，另外在 Nef 結(jié)構(gòu)區(qū)域插入 IRES-eYFP 基因) 。這種人造的 RCL 可賦予病毒獨(dú)特的性質(zhì)( 包含 VSVG 或雙嗜性 Env 順式配置) 。結(jié)果表明: 采用這種人為制造的 RCL 轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞進(jìn)行靈敏度驗(yàn)證，可達(dá)到 100 IU·mL^-1。其次，該方法不同于 p24 ELISA 和 Q-PCR 方法( 僅是依賴 HIV 的基因產(chǎn)物而不是實(shí)際的 RCL) ，其檢測過程是基于 RCL 可以激發(fā)含有整合性復(fù)制缺陷病毒表達(dá)抗性基因。

但不可否認(rèn)的是，雖然這種人為制造的 RCL 包含有效病毒復(fù)制所必需的順式和反式作用元件，而這種結(jié)構(gòu)可能不是在 293T 細(xì)胞生產(chǎn)慢病毒過程中恢復(fù)突變產(chǎn)生的典型 RCL，因此無法證實(shí)該方法在基因治療產(chǎn)品中檢測 RCL 的準(zhǔn)確性和特異性。另外現(xiàn)有文獻(xiàn)資料尚不清楚來自載體生產(chǎn)過程中回復(fù)突變形成的 RCL 是否會激活標(biāo)志物。*后這種測定方法和細(xì)胞共培養(yǎng)法的時間周期一樣，整個測試周期需要 3 ～ 6 周。

載體和病毒顆粒之間的相似性增加了 RCL 檢測的復(fù)雜性，RCL 的許多組分與載體顆粒( 衣殼、整合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶) 的組分相似，因此大多數(shù)蛋白檢測方法都存在誤差。如前文所描述的幾種檢測方法，基于快速放行的 PCR /QPCR 方法會因?yàn)榧?xì)胞或質(zhì)粒 DNA 攜帶到載體產(chǎn)物中導(dǎo)致假陽性率的發(fā)生;合胞體形成測定法僅適合具有全能力的、包含 Env元件慢病毒，且該方法的靈敏度尚未得到廣泛研究驗(yàn)證; 標(biāo)志物補(bǔ)救測定法尚不清楚來自載體生產(chǎn)過程中的 RCL 是否會激活標(biāo)志物; 逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定法( PERT) 不能區(qū)分 RCL 和載體顆粒，且細(xì)胞中固有的內(nèi)源性病毒顆粒也會影響檢測結(jié)果的判斷。迄今為止，所有非培養(yǎng)測定法都缺乏基于培養(yǎng)的測定法的敏感性，根據(jù) FDA 2006 年發(fā)布的關(guān)于 ＲCＲ 檢測的指南和 2018 年*新更新的檢測指南征求意見稿，目前 RCR /RCL 檢測的金標(biāo)準(zhǔn)是共培養(yǎng)法，即將測試樣品( 病毒載體上清液、生產(chǎn)終末細(xì)胞、體外轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞等) 與允許細(xì)胞系進(jìn)行共培養(yǎng)，至少 5 次傳代以擴(kuò)增任何潛在的 RCR /RCL，然后通過指示細(xì)胞法或檢測特異性核酸/蛋白的方法進(jìn)行測定。

我國自 2017 年 12 月頒布《細(xì)胞治療用產(chǎn)品的研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》(試行版) 以來，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心陸續(xù)與申請人針對多個品種召開溝通交流會，也邀請了工業(yè)界、研究機(jī)構(gòu)相關(guān)專家就 IND 階段細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究及申報(bào)資料考慮要點(diǎn)展開討論，并達(dá)成相關(guān)共識，*大程度提高了 CAR-T 產(chǎn)品研發(fā)和申報(bào)資料的質(zhì)量。經(jīng)粗略統(tǒng)計(jì)，目前進(jìn)入中心待審評以及審評完成的品種數(shù)量已超過 10 余家，且部分申報(bào)企業(yè)已獲得臨床批件。

回顧目前的審評資料，各家針對 RCL 檢測方法存在較大差異，筆者分析原因: 一方面由于對 RCL風(fēng)險(xiǎn)重視程度不足，第二方面大多數(shù)參照 FDA 已批準(zhǔn)產(chǎn)品的放行檢測方法進(jìn)行照搬( Q-PCR 法) ，而未對該產(chǎn)品在過程中如何控制進(jìn)行深入研究，第三是由于國內(nèi)還未有相關(guān)檢測機(jī)構(gòu)，且未建立成熟的檢測方法。筆者認(rèn)為，雖然目前臨床使用的載體系統(tǒng)已經(jīng)改進(jìn)，且基于國內(nèi)外研究報(bào)道還未發(fā)現(xiàn)存在RCL 的風(fēng)險(xiǎn)，但我們目前對形成RCL 的重組機(jī)制的認(rèn)知有限，同時細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)過程中 RCL 的控制是影響產(chǎn)品質(zhì)量和臨床用藥安全性的關(guān)鍵因素。建議申請人可參考 FDA *新頒布的《關(guān)于 RCR /RCL 檢測征求意見稿》適用的內(nèi)容，在細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)過程中加強(qiáng)對 RCL 的檢測及控制，并建議在慢病毒載體上清液和生產(chǎn)終末細(xì)胞采用基于細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行檢測，對于新鮮輸注細(xì)胞或其他時間限制的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，在積累了足夠的基于細(xì)胞培養(yǎng)方法無 RCR /RCL風(fēng)險(xiǎn)的足夠數(shù)據(jù)時，可采用 PCR 方法作為快速放行方法，但對于替代方法應(yīng)提供充分的方法靈敏度、特異性和重復(fù)性驗(yàn)證數(shù)據(jù)。

未來隨著科學(xué)的進(jìn)步和對 RCL 認(rèn)知的加深，以及新技術(shù)和新方法的應(yīng)用，我們希望能與業(yè)界專家共同探討，一切從患者安全性角度考慮，在減輕申請人大量檢測投入的基礎(chǔ)上尋求更加安全、便捷和準(zhǔn)確的檢測方法。

參考來源：崔靖,韋薇,羅建輝.復(fù)制能力慢病毒檢測方法的研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志,2019,28(22):2718-2723.