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病毒中和試驗實驗方法介紹

作者:百檢網(wǎng) 時間:2021-11-02 來源:互聯(lián)網(wǎng)

病毒中和試驗主要有兩種實驗方法:固定病毒–稀釋抗血清法和固定抗血清–稀釋病毒法。

固定病毒–稀釋抗血清法
該病毒中和試驗方法主要用于血清抗體滴度的測量。將 100 CCID50/單位體積的病毒分別與連續(xù)倍比稀釋的病人急性期或恢復(fù)期血清混合孵育 1 h 后,把混合液接種于敏感宿主,然后觀察不同稀釋度的血清保護宿主感染病毒的情況。
實驗材料:
具有感染力的病毒(已滴定的標準病毒 100 TCID50 0. 1 ml 或 100 LD50 0. 1 ml)
試劑、試劑盒:
病毒抗體陽性的血清和病毒抗體陰性的血清:急性期或恢復(fù)期血清(通常 56℃ 30 min 滅活) 敏感宿主體系:敏感細胞、敏感動物、雞胚
儀器、耗材:
96 孔細胞培養(yǎng)板
實驗步驟:以細胞培養(yǎng)為例
①用細胞維持液連續(xù)倍比稀釋急性期和恢復(fù)期血清;
②取1. 0 ml 不同濃度的稀釋血清分別與 1. 0 ml 標準病毒 (100 CCID50/0. 1 m) 混合,置 37℃水浴作用1 h;
③取混合液 0. 2 ml 分別加到細胞已長成單層的 96 孔細胞培養(yǎng)板中,每一稀釋度接種 4孔細胞。同時設(shè) 4孔正常細胞對照和設(shè) 4 孔 100 CCID50/0. 2 ml 作病毒對照;
④設(shè)病毒滴度對照。將病毒液連續(xù) 10倍稀釋后,加到細胞已長成單層的 96 孔細胞培養(yǎng)板中,每個稀釋度接種 4孔細胞,每孔加 0. 1 ml。必要時還要設(shè)抗體陽性血清對照和抗體陰性血清對照。
⑤將 96 孔細胞培養(yǎng)板置 37℃、 5% CO2 溫箱中孵育,每日觀察細胞病變效應(yīng) (CPE) 。
⑥50% 血清中和終點的計算: 50% 細胞不產(chǎn)生細胞病變 (CPE) 的血清稀釋度。根據(jù)細胞病變程度,用 Reed-Muench 法計算 50%血清中和終點。
注意事項:
1. 病毒懸液病毒應(yīng)低溫保存,融化后只可使用一次,避免反復(fù)凍融,這樣會降低病毒的毒力。多次進行同一試驗時,應(yīng)使用同一批凍存的病毒,以減小誤差。
2. 抗血清人和動物血清中含有一些非特異性的物質(zhì),這些物質(zhì)可增強抗病毒抗體的中和作用,也可以滅活病毒,通常采用加熱的方法破壞這些物質(zhì)。不同來源的血清滅活溫度不盡相同,人、豚鼠血清為 56℃, 兔為 65℃, 時間為 20~30 min。在細胞培養(yǎng)中進行中和試驗時,要注意避免使用相同的細胞。
3. 孵育的溫度和時間 病毒與抗血清在 0℃時不發(fā)生反應(yīng), 5℃以上才發(fā)生中和反應(yīng)。通常采用 37℃ 孵育1 h, 一般的病毒即可和抗血清充分反應(yīng)。但是,一些特殊的病毒在此反應(yīng)條件下不能充分反應(yīng),試驗時應(yīng)根據(jù)不同的病毒改變孵育的時間和溫度。
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固定抗血清–稀釋病毒法
實驗材料:已知標準的抗病毒血清 (20抗體單位 0. 1 ml)
試劑、試劑盒:已知陰性血清 (56℃ 30 min 滅活) 宿主:敏感細胞、敏感動物、雞胚
儀器、耗材:細胞培養(yǎng)板、水浴鍋、細胞培養(yǎng)箱
實驗步驟:
①用細胞維持液連續(xù) 10倍稀釋病毒分離物10-1~10-8);
②取 0. 6ml不同濃度的病毒稀釋液與 0. 6 ml 標準的抗病毒血清混合;
③再取 0.6ml 不同濃度的病毒稀釋液與 0. 6 ml 已知的陰性血清混合;
④將混合液置 37℃ 水浴1h, 然后取 0. 2 ml 混合液分別接種于細胞已長成單層的 96孔細胞培養(yǎng)板中,每一稀釋度接種 5孔,設(shè) 5 孔正常細胞對照;
⑤將細胞培養(yǎng)板置 37℃ 、 5% CO2 溫箱中孵育,每日觀察細胞病變效應(yīng) (CPE) 。
⑥中和試驗的病毒 CCID50 的計算:細胞培養(yǎng)中,通常是以病毒的組織半數(shù)感染量 (CCID50/單位體積)作為中和反應(yīng)的終點。而動物試驗中,用動物半數(shù)致死量 (LD50/單位體積)作為中和反應(yīng)的終點。中和試驗中,抗血清組的 CCID50 與陰性血清組的 CCID50 之差的對數(shù)等于或大于2, 才能說明中和試驗結(jié)果為陽性。
注意事項:
用中和試驗方法鑒定病毒時,將不同稀釋倍數(shù)的病毒與標準的抗血清 (20個抗體單位/單位體積)混合、孵育,使二者充分反應(yīng),然后將混合液接種到敏感宿主體內(nèi),觀察試驗結(jié)果。

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