1 范圍

本標準規定了肥料中糞大腸菌群的測定方法

2 定義

下列定義適用于本標準

糞大腸菌群 fecal coliforms

群在44.5℃±0.5℃條件能發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌

糞大腸菌群數為每克(毫升)肥料樣品中糞大腸菌群的*可能數(MPN)。

3 儀器設備

高壓蒸汽滅菌器;顯微鏡;恒溫水浴或隔水式培養箱;恒溫旋轉式搖床;干燥箱;天平;酸度計或精密pH試紙;接種環;試管(15mm×150mm);小套管(杜蘭管);移液管、三角瓶、培養皿、載玻片、玻璃珠酒精燈、試管架。

4 培養基和試劑

4.1 培養基:遵照附錄A的規定

4.2 革蘭氏染色液:遵照附錄B的規定

5 檢驗步驟

樣品稀釋

在無菌操作下稱取樣品10.0g或吸取樣品10mL,加入到帶玻璃珠的90mL無菌水中,置于搖床200r/min充分振蕩30min,即成0.1稀釋液

用無菌移液管吸取5.0ml上述稀釋液加入到45mL無菌水中,混勻成0.01稀釋液。這樣依次稀釋,分別得到0.001,0.0001等濃度稀釋液(每個稀釋度須更換無菌移液管)

5.2 乳糖發酵試驗

選取三個連續適宜稀釋液,分別吸取不同稀釋液1.0mL加入到乳糖膽鹽發酵管內,每一稀釋度接種3支發酵管,置44.5℃士0.5℃恒溫水浴或隔水式培養箱內,培養24h±2h。如果所有乳糖膽鹽發酵

管都不產酸不產氣,則為糞大腸菌群陰性;如果有產酸產氣或只產酸的發酵管,則按5.3進行

5.3 分離培養

從產酸產氣或只產酸的發酵管中分別挑取發酵液在伊紅美藍瓊脂平板上劃線,置36℃±1℃條件下培養18h~24h

5.4 證實試驗

從5.3分離平板上挑取可疑菌落,進行革蘭氏染色。染色反應陽性者為糞大腸菌群陰性;如果為革蘭氏陰性無芽胞杄菌則挑取同樣菌落接種在乳糖發酵管中,置4.5℃±0.5℃條件下培養24h±2h觀察產氣情況,不產氣為糞大腸菌群陰性;產氣為糞大腸菌群陽性

5 結果

證實試驗為糞大腸菌群陽性的,根據糞大腸菌群陽性發酵管數,查MPN檢索表,得出每克(毫升)料樣品中的糞大腸菌群數

GB/T19524.1—2004 附錄A(規范性附錄)

培養基

A.1 乳糖膽鹽發酵培養基

蛋白胨 20.0g

豬膽鹽 5.0g

乳糖 10.0g

0.004%溴甲酚紫水溶液 25.0mL

蒸餾水 1000mL

PH值 7.2~7.4

制法:將蛋白胨豬膽鹽及乳糖溶解于蒸餾水中,校正pH,加入溴甲酚紫水溶液,然后分裝試管,每管9mL,并放入一支倒置的小套管,高壓滅菌115℃、15min。

注1:初發酵培養基

注2:糞大腸菌群細菌發酵乳糖產酸產氣使培養液由紫色變成黃色,套管內充有氣體

A.2 伊紅美藍瓊脂培養基

磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O) 2.0g

瓊脂 20.0g

2%伊紅Y水溶液 20.0mL

0.65%美藍水溶液 10.0mL

pH值 7.2~7.4

制法:將蛋白胨、乳糖、磷酸氫二鉀溶解于蒸餾水中,校正pH,投入瓊脂并加熱溶解,分裝于三角瓶中,高壓滅菌115℃、15min備用。伊紅和美藍溶液分別高壓滅菌121℃、20min。臨用時加熱熔化培養基,冷卻至50℃~55℃,加入無菌的伊紅和美藍溶液,播勻傾注平板。

A.3 乳糖發酵培養基

制法:將蛋白胨及乳糖溶于水中,校正pH,加入指示劑,按檢驗要求分裝3mL~5mL,并放入1支倒置的小套管,高壓滅菌115℃、15min。

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下載地址：《GB/T 19524.1-2004 肥料中糞大腸菌群的測定》