1 范圍

SN/T 3084 的本部分規定了化妝品眼刺激性角膜細胞試驗方法。

本部分適用于化妝品原料和成品眼刺激性體外篩選試驗。

本部分適用于部分化妝品使用的表面活性劑的篩選測試。

本部分可作為眼刺激性動物試驗的替代方法之一。可以結合其他眼刺激替代試驗，對眼刺激效應進行綜合評價。

本部分可作為其他領域眼刺激體外測試的參考方法。

2 規范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其*新版本(包括所有的修改單)適用于本文件

SN/T 2285 化妝品體外替代試驗實驗室規范

3 術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1 眼刺激性 eye irritation

眼球表面接觸受試樣品后產生的可逆性炎性變化。

3.2 SIRC細胞系 statens seruminstitut rabbit cornea cell line

來源于兔眼角膜組織的成纖維細胞系。

3.3 STE試驗 short time exposure test

采用SIRC細胞進行的短時間暴露試驗，本部分指5min暴露試驗。

4 原理

本試驗采用來源于眼刺激靶器官的SIRC細胞系，將樣本干預細胞5min，然后去除。采用CCK-8細胞毒性測試法( cell counting kit-8 cytotoxicity test)，使干預后的細胞與CCK-8試劑反應，活細胞線粒體中的脫氫酶會將CCK-8試劑還原成橙黃色的甲臢染料，活細胞越多，被還原成的染料越多，顏色深淺與細胞數目呈線性關系。通過測定波長450nm時的吸光度值，計算細胞的生存率，判斷樣品的眼刺激性。本部分為STE短時暴露試驗，適用于不同溶解性狀的樣本。

5 儀器與試劑耗材

5.1 儀器

5.1.1 Ⅱ級生物安全柜。

5.1.2 二氧化碳培養箱：溫度37℃±1℃，濕度90%±5%，5%±1%CO2濃度。

5.1.3 恒溫水浴箱：溫度37℃±1℃。

5.1.4 倒置顯微鏡。

5.1.5 酶標儀。

5.1.6 電子大平：0.1mg量程。

5.1.7 細胞計數儀或血球計數器。

5.1.8 離心機。

5.1.9 混懸儀。

5.1.10 真空吸液泵。

5.1.11 程序降溫儀。

5.1.12 液氮罐。

5.1.13 5μL~50μL，10μL~100μL，20μL~200μL量程排槍。

5.1.14 細胞凍存盒。

5.2 試劑耗材

5.2.1 MEM培養基( minimum essential medium)

5.2.2 胎牛血清(FBS)：56℃加熱滅30min。

5.2.3 0.25%胰酶/EDTA溶液(Trypsin/EDTA)：0.25%胰酶溶液與0.02 mol/L EDTA溶液1：1混均。

5.2.4 青霉素/鏈霉素雙抗：工作溶液青霉素(100U/mL鏈霉素(100μg/mL)。

5.2.5 MEM完全培養基：含10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL霉素。

5.2.6 二甲基亞砜(DMSO)。

5.2.7 細胞凍存培養基：含20%FBS、10%DMSO的MEM培養基。

5.2.8 磷酸鹽緩沖液(PBS)。

5.2.9 礦物油：細胞培養級。

5.2.10 0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)：稱取0.01gSDS于10mL無菌試管中，加入PBS至10mL。

5.2.11 5%吐溫20(TWEEN20)：稱取0.5 g TWEEN20于10mL無菌試管中，加入PBS至10mL。

5.2.12 CCK-8試劑。

5.2.13 50mL無菌離心管。

5.2.14 無菌吸管(5mL，10mL)。

5.2.15 10mL無菌試管。

5.2.16 細胞培養瓶及培養板：25cm2、75cm2培養瓶：96孔平底細胞培養板。

6 試驗方法

6.1 基本要求

試驗過程應符合SN/T 2285 的要求。為保證溯源性，SIRC細胞應由有資質的細胞庫提供，選擇0代之內的細胞進行試驗。所有細胞培養相關操作步驟都應在Ⅱ級生物安全柜里進行，確保無菌操作。

6.2 細胞培養

6.2.1 SIRC細胞培養

購置的SIRC細胞，更換MEM完全培養基，在37℃±1℃，濕度90%±5%，CO2濃度5.0%±1%條件下進行培養(后續試驗細胞培養均按此條件)。

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