1.范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中β型溶血性鏈球菌( Streptococcus)的檢驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中β型溶血性鏈球菌的檢驗(yàn)。

2.術(shù)語和定義

2.1 B型溶血

在菌落周圍形成完全透明的溶血環(huán),紅細(xì)胞完全溶解。

2.2 β型溶血性鏈球菌

能夠產(chǎn)生β型溶血的化膿(或A群)鏈球菌( Streptococcus pν genes)和無乳(或B群)鏈球(Streptococcus agalactiae）。

3.設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:

a) 恒溫培養(yǎng)箱:36℃C±1℃；

b) 冰箱:2℃～5℃;

c) 厭氧培養(yǎng)裝置;

d) 天平:感量0.1g；

e) 均質(zhì)器與配套均質(zhì)袋；

f) 顯微鏡:10倍～100倍;

g) 無菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.lmL刻度)或微量移液器及吸頭;

h) 無菌錐形瓶:容量100mL、200mL、2000mL；

i) 無菌培養(yǎng)皿:直徑90mm；

j) pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙;

k) 水浴裝置:36℃±1℃；

l) 微生物生化鑒定系統(tǒng)。

4.培養(yǎng)基和試劑

4.1 改良胰蛋白胨大豆肉湯( Modified tryptone soybean broth,mTSB):見附錄A中A.1。

4.2 哥倫比亞CNA血瓊脂( Columbia cna blood agar):見附錄A中A.2。

4.3 哥倫比亞血瓊脂( Columbia blood agar):見附錄A中A3。

4.4 革蘭氏染色液:見附錄A中A4。

4.5 胰蛋白胨大豆肉湯( Tryptone soybean broth,TSB):見附錄A中A.5。

4.6 草酸鉀血漿:見附錄A中A.6。

4.7 0.25%氯化鈣(CaCl2)溶液:見附錄A中A.7。

4.8 3%過氧化氫H2O2)溶液:見附錄A中A8。

4.9 生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡。

5.檢驗(yàn)程序

溶血性鏈球菌檢驗(yàn)程序見圖1。

6.操作步驟

6.1 樣品處理及增菌

按無菌操作稱取檢樣25g(mL),加入盛有225mL mTSB的均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1min～2min;或加入盛有225mL mTSB的均質(zhì)杯中,以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min。若樣品為液態(tài),振蕩均勻即可。36℃±1℃培養(yǎng)l8h～24h。

6.2 分離

將增菌液劃線接種于哥倫比亞CNA血瓊脂平板,36℃±1℃厭氧培養(yǎng)18h～24h,觀察菌落形態(tài)。溶血性鏈球菌在哥倫比亞CNA血瓊脂平板上的典型菌落形態(tài)為直徑約2mm～3mm,灰白色、半透明、光滑、表面突起、圓形、邊緣整齊,并產(chǎn)生β型溶血。

6.3 鑒定

6.3.1 分純培養(yǎng)

挑取5個(gè)(如小于5個(gè)則全選)可疑菌落分別接種哥倫比亞血瓊脂平板和TSB增菌液,36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。

6.3.2 革蘭氏染色鏡檢

挑取可疑菌落染色鏡檢。β型溶血性鏈球菌為革蘭氏染色陽性,球形或卵圓形,常排列成短鏈狀。

6.3.3 觸酶試驗(yàn)

挑取可疑菌落于潔凈的載玻片上,滴加適量3%過氧化氫溶液,立即產(chǎn)生氣泡者為陽性。β型溶血性鏈球菌觸酶為陰性。

6.3.4 鏈激酶試驗(yàn)(選做項(xiàng)目)

吸取草酸鉀血漿0.2mL于0.8mL滅菌生理鹽水中混勻,再加入經(jīng)36℃±1℃培養(yǎng)l8h～24h的可疑菌的TSB培養(yǎng)液0.5mL及0.25%氯化鈣溶液0.25mL,振蕩搖勻,置于36℃±1℃水浴中10min,血漿混合物自行凝固(凝固程度至試管倒置,內(nèi)容物不流動(dòng))。繼續(xù)36℃±1℃培養(yǎng)24h,凝固塊重新完全溶解為陽性,不溶解為陰性,β型溶血性鏈球菌為陽性。

6.3.5 其他檢驗(yàn)

使用生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡對可疑菌落進(jìn)行鑒定。

7.結(jié)果與報(bào)告

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果,報(bào)告每25g(mL)檢樣中檢出或未檢出溶血性鏈球菌。

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