1.范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群( Coliforms)計數(shù)的方法。

本標(biāo)準(zhǔn)**法適用于大腸菌群含量較低的食品中大腸菌群的計數(shù);第二法適用于大腸菌群含量較高的食品中大腸菌群的計數(shù)。

2.術(shù)語和定義

2.1 大腸菌群 Coliforms

在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。

2.2 *可能數(shù) Most probable number;MPN

基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法。

3.檢驗(yàn)原理

3.1 MPN法

MPN法是統(tǒng)計學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測法。待測樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后,根據(jù)其未生長的*低稀釋度與生長的*高稀釋度,應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)概率論推算岀待測樣品中大腸菌群的*大可能數(shù)。

3.2平板計數(shù)法

大腸菌群在固體培養(yǎng)基中發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸,在指示劑的作用下形成可計數(shù)的紅色或紫色,帶有或不帶有沉淀環(huán)的菌落。

4.設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下：

4.1 恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃C。

4.2 冰箱:2℃～5℃

4.3 恒溫水浴箱:46℃±1℃

4.4 天平:感量0.1g。

4.5 均質(zhì)器。

4.6 振蕩器。

4.7 無菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。

4.8 無菌錐形瓶:容量500mL。

4.9 無菌培養(yǎng)皿:直徑90mm。

4.10 pH計或pH比色管或精密pH試紙。

4.11 菌落計數(shù)器。

5.培養(yǎng)基和試劑

5.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨( lauryl sulfate tryptose,LST)肉湯:見A.1。

5.2 煌綠乳糖膽鹽( brilliant green lactose bile,BGLB)肉湯:見A.2。

5.3 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂( violet red bile agar,VRBA):見A.3。

5.4 無菌磷酸鹽緩沖液:見A.4。

5.5 無菌生理鹽水:見A.5。

5.6 1mol/ L NaOh溶液:見A.6。

5.7 1mol/LHCl溶液:見A.7。

**法大腸菌群MPN計數(shù)法

6.檢驗(yàn)程序

大腸菌群MPN計數(shù)的檢驗(yàn)程序見圖1。

7.操作步驟

7.1 樣品的稀釋

7.1.1 固體和半固體樣品:稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000r/min~10000r/min均質(zhì)lmin~2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min,制成1:10的樣品勻液。

7.1.2 液體樣品:以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)或其他無菌容器中充分振搖或置于機(jī)械振蕩器中振搖,充分混勻,制成1:10的樣品勻液。

7.1.3 樣品勻液的pH應(yīng)在6.5~7.5之間,必要時分別用1mol/ L Nah或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。

7.1.4 用ⅠmL無菌吸管或微量移液器吸取Ⅰ:10樣品勻液lmL,沿管壁緩緩注9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭**不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打,使其混合均勻,制成1:100的樣品勻液。

7.1.5 根據(jù)對樣品污染狀況的估計,按上述操作,依次制成十倍遞増系列稀釋樣品勺液。每遞増稀釋1次,換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢,全過程不得超過15min。

7.2 初發(fā)酵試驗(yàn)

每個樣品,選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯,每管接種ⅠmL(如接種量超過ⅠmL,則用雙料LST肉湯),36℃士1℃培養(yǎng)24h土2h,觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生,24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)(證實(shí)試驗(yàn)),如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h士2h,產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。

7.3 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)(證實(shí)試驗(yàn))

用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物Ⅰ環(huán),移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)管中36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h,觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者,計為大腸菌群陽性管。

7.4 大腸菌群*可能數(shù)(MPN)的報告

按7.3確證的大腸菌群BGLB陽性管數(shù),檢索MPN表(見附錄B),報告每g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值。

第二法大腸菌群平板計數(shù)法

8.檢驗(yàn)程序

大腸菌群平板計數(shù)法的檢驗(yàn)程序見圖2。

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