1 范圍

本標準規定了用液相色譜伩和液相色譜-串聯質譜儀測定飼料中的孔雀石綠及其同系物無色孔雀石綠含量的方法。

本標準分為高效液相色譜法和髙效液相色譜串聯質譜法，髙效液相色譜-串聯質譜法為確證法。

本標準適用于配合飼料、濃縮飼料、添加劑預混合飼料、魚粉中孔雀石綠和無色孔雀石綠含量的測定。

液相色譜法孔雀石綠和無色孔雀石綠的定量限均為l0μg/kg；液相色譜-串聯質譜法的定量限均為1.0μg/kg。

2 規范性引用文件

下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的*新版本。凡是不注日期的引用文件，其*新版本適用于本標準。

GB/T 6682 分析實驗室用水規格和試驗方法

GB/T 14699.1 飼料采樣

GB/T 20195 動物飼料試樣的制備

3 采樣

按GB/T 14699.1 執行。

4 試樣的制備

選取有代表性飼料樣品，按GB/T 20195 制備樣品，過0.28mm孔篩。

5 液相色譜法

5.1 原理

以乙腈-乙酸鈉緩沖溶液提取樣品中的孔雀石綠和無色孔雀石綠，提取液經過二氯甲烷液液萃取，再經固相萃取柱凈化，用接有二氧化鉛柱的氰基柱進行高效液相色譜分離，紫外可見光檢測器檢測，外標法定量。

5.2 試劑

除非另有規定，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和符合GB/T 6682 規定的一級用水。

5.2.1 孔雀石綠草酸鹽標準品：純度≥95%。

5.2.2 無色孔雀石綠標準品：純度≥95%。

5.2.3 乙腈：色譜純。

5.2.4 二氯甲烷。

5.2.5 鹽酸羥胺溶液：稱取12.5g鹽酸羥胺溶于50mL水中。

5.2.6 乙酸鈉緩沖溶液：稱取4.95g無水乙酸鈉和0.95g對甲苯磺酸于900ml水中，用冰乙酸調節pH45，用水定容至100mL。

5.2.7 1.0mol/L對甲苯磺酸溶液：稱取17.2g對甲苯磺酸，加水溶解并定容至100mL。

5.2.8 酸性氧化鋁，粒度為0.071nm~0.1501nm，層析用。

5.2.9 乙腈-乙酸鈉緩沖溶液：乙腈十乙酸鈉=60+40(V+V)。

5.2.10 氯化鈉溶液：稱取25g氯化鈉，加水溶解并定容至500mL。

5.2.11 孔雀石綠標準貯備溶液：精確稱取孔雀石綠草酸鹽(5.2.1)O.l000g，用乙腈溶解，定容至100 ml。該溶液中孔雀石綠的濃度為1mg/mL，于-18℃保存可使用3個月。

5.2.12 無色孔雀石綠標準貯備溶液：精確稱取無色孔雀石綠(5.2.2)0.1000g，用乙腈溶解，定容至100mL，該溶液中無色孔雀石綠濃度為lmg/mL，于-18℃保存可使用3個月。

5.2.13 孔雀石綠和無色孔雀石綠混合中間液：精確移取孔雀石綠標準貯備溶液(5.2.11)和無色孔雀石綠標準貯備溶液(5.2.12)各0.5mL，置于50mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度。該溶液中孔雀石綠和無色孔雀石綠均為10g/mL，于2℃~8℃保存可使用1個月。

5.2.14 孔雀石綠和無色孔雀石綠標準工作液：精確移取孔雀石綠和無色孔雀石綠混合中間液(5.2.13)lmL，置于l00mL棕色容量瓶中，用乙腈乙酸鈉緩沖溶浟(5.2.9)定容至刻度。該溶液中孔雀石綠和無色孔雀石綠均為100mg/mL，于分析前配制使用。

5.2.15 鹽酸羥胺甲醇溶液：取lm鹽酸羥胺溶液(5.2.4)，加甲醇定容至100mL。

5.3 儀器

5.3.1 高效液相色譜儀：配紫外可見光檢測器。

5.3.2 電子天平：感量0.001g、感量0.001g。

5.3.3 離心機，轉速4000r/min。

5.3.4 振蕩器。

5.3.5 旋轉蒸發器，可控溫25℃~40℃。

5.3.6 固相萃取柱：丙基磺酸陽離子樹脂PRS( propylsulfonic acid)柱：200mg/5mL~500mg/5mL中性氧化鋁柱：500mg/6mL~1000mg/6mL

5.3.7 色譜柱：氰基柱(粒度為5μm)，柱長250mm、內徑4.6mm。

5.3.8 二氧化鉛柱：柱長35mm、內徑46mm。

5.4 分析步驟

5.4.1 提取

稱取飼料樣品約5g(精確到0.001lg)，置于100mL離心管中，依次加入1.5mL鹽酸羥胺溶液(5.2.5)、2mL對甲苯磺酸溶液(5.2.7)、5mL乙酸鈉緩沖溶液(5.2.6）和20mL乙腈，加入約2g酸性氧化鋁(5.2.8)，振蕩2min，超聲30min，4000r/min離心5min。將上清液轉移至250mL分液漏斗中，向離心管中再次加入20mL乙腈，振搖2min，4000r/min離心5min，合并上清液至分液漏斗中。

5.4.2 液液萃取

加入50mL氯化鈉溶液(5.2.10)、50mL二氯甲烷(5.2.4)，旋搖，靜置分層。用蒸發瓶收集下層液體后，在分液漏斗再次加入2mL二氯甲烷，旋搖，靜置分層，收集下層液體于同一蒸發瓶。將收集液在35℃下減壓旋轉蒸發(注意：開始時溫度不要直接升到35℃，以免爆沸)至近干，加入5mL乙腈溶解殘渣，備用。

5.4.3 凈化

5.4.3.1 固相萃取柱的活化

按中性氧化鋁柱在上、PRS柱在下的順序將兩柱串聯，使用前用5mL乙腈預洗兩柱。

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下載地址：《NY/T 1756-2009 飼料中孔雀石綠的測定》