1 范圍

本標準規定了飼料中細菌總數的測定方法

本標準適用于配合飼料濃縮飼料、飼料原料(魚粉等)、牛精料補充料中細菌總數的測定。

2 規范性引用文件

下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準,然而,鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的*新版本。凡是不注日期的引用文件,其*新版本適用于本標準。

GB/T 6682 分析實驗室用水規格和試驗方法

GB/T 14699.1 飼料采樣

GB/T 20195-2006 動物飼料試樣的制備

3 術語和定義

下列術語和定義適用于本標準

3.1 細菌總數 bacterial count

飼料試樣經過處理,在一定條件下(如培養成分、培養溫度和時間等)培養后,所得1g(mL)試樣中含細菌總數。

注:主要作為判定飼料被污染程度的標志,也可以應用這一方法觀察細菌在飼料中繁殖的動態,以便對被檢樣品進行衛生學評價時提供依據。

4 原理

試樣經過處理,稀釋至適當濃度,在一定條件(如用特定的培養基,在溫度30℃±1℃培養72h±3h等)下培養后,所得1g(mL)試樣中所含細菌總數。

5 設備及材料

5.1 分析天平:感量0.1g

5.2 震蕩器:往復式。

5.3 粉碎機:非旋風磨,密閉要好。

5.4 高壓滅菌器:滅菌壓力0~3kg/cm2。

5.5 冰箱:普通冰箱

5.6 恒溫水浴鍋:46℃±1℃

5.7 恒溫培養箱:30℃士1℃。

5.8 微型混合器。

5.9 滅菌三角瓶:100mL、250mL、500mL

5.10 滅菌移液管:1mL、10mL。

5.11 滅菌試管:16mm×160mm。

5.12 滅菌玻璃珠:直徑5mm。

5.13 滅菌培養皿:直徑90mm。

5.14 滅菌金屬勺、刀等

6 培養基和試劑

6.1 營養瓊脂培養基:見附錄A。

6.2 磷酸鹽緩沖液(稀釋液):見附錄A

6.3 0.85%生理鹽水:見附錄A。

6.4 水瓊脂培養基:見附錄A。

6.5 實驗室常見消毒藥品。

7 試樣的制備

按照GB/T14699.1進行采樣,采樣時應特別注意樣品的代表性和避免采樣時的污染。

按照GB/T20195-2006進行樣品的制備,磨碎過0.45mm孔徑篩。樣品應盡快檢驗

8 測定程序

細菌總數測定程序見圖1。

9 測定步驟

1 試樣稀釋及培養

9.1.1 以無菌操作稱取試樣(第7章)25g(或10g),放于含有225mL(或90mL)稀釋液或生理鹽水的滅菌三角瓶中(瓶內預置適當數量的玻璃珠)。置振蕩器上振蕩30min。經充分振搖后,制成1:10的均勻稀釋液。*好置均質器中8000r/min~10000r/min的速度處理1min。

9.1.2 用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,沿管壁慢慢注入含有9mL滅菌稀釋液或生理鹽水的試管中(注意吸管**不要觸及管內稀釋液),振搖試管,或放微型混合器上,混合30s,混合均勻,制成1:100的稀釋液

9.1.3 另取一只1mL滅菌吸管,按上述操作方法,作10倍遞增稀釋,如此每遞增稀釋一次,即更換支滅菌吸管

9.1.4 根據飼料衛生標準要求或對試樣污染程度的估計,選擇2個~3個適宜稀釋度,分別在作10倍遞增稀釋的同時,即以吸取該稀釋的吸管移1mL稀釋液于滅菌平皿內,每個稀釋度作兩個培養皿

9.1.5稀釋液移人培養皿后,應及時將涼至46℃±1℃的培養基(可放置46℃±1℃水浴鍋內保溫)注入培養皿約15mL,小心轉動培養皿使試樣與培養基充分混均。從稀釋試樣到傾注培養基之間,時間不能超過30min

如估計試樣中所含微生物可能在培養基平皿表面生長時,待培養基完全凝固后,可在培養基表面傾注涼至46℃士1℃的水瓊脂培養基4mL

9.1.6 待瓊脂凝固后,倒置平皿于30℃±1℃恒溫培養箱內培養72h士3h取出,計算平板內細菌總數目,細菌總數乘以稀釋倍數,即得每克試樣所含細菌總數

9.2 細菌總數計算方法

做平板菌落計數時,可用肉眼觀察,如菌落形態小時可借助于放大鏡檢查,以防遺漏。在計算出各平板細菌總數后,求出同稀釋度的兩個平板菌落的平均值

9.3 細菌總數計數的報告

9.3.1 平板細菌總數的選擇

選擇細菌總數在30~300之間的平板作為細菌總數測定標準。每一稀釋度使用兩個平板菌落的平均數,兩個平板其中一個平板有較大片狀菌落生長時,則不宜采用,而應以無片狀菌落生長的平板菌落的平均數作為該稀釋度的細菌總數,若片狀菌落不到平板半,而另一半菌落分布又很均勻,即可計算半個平板后乘2以代表全平皿細菌總數

9.3.2 稀釋度的選擇

9.32.1 應選擇平均細菌總數在30~300之間的稀釋度,乘以稀釋倍數報告之(見表1中例次1)

9.3.2.2 若 有兩個稀釋度,其生長的細菌總數均在30~300之間,則視兩者之比如何來決定。若其比值小于或等于2,應報告其平均值;若大于2則報告其中較小的數字(見表1中例次2及例次3)。

9.3.2.3 若所有稀釋度的平均細菌總數均大于300,則應按稀釋度*高的平均細菌總數乘以稀釋倍數報告之(見表1中例次4)

9.3.2.4 若所有稀釋度的平均細菡總數均小于30,則應按稀釋度*低的平均細菌總數乘以稀釋倍數報告之(見表1中例次5)

9.3.2.5 若所有稀釋度均無菌落生長,則以小于1乘以*低稀釋倍數報告之(見表1中例次6)

93.2.6 若所有稀釋度的平均細菌總數均不在30~300之間,其中一部分大于300或小于30時,則以*接近30或300的平均細菌總數乘以稀釋倍數報告之(見表1中例次7)

9.3.3 細菌總數的報告

細菌總數在100以內時,按其實有數報告,大于100時,采用兩位有效數字,在兩位有效數字后面的數值,以四舍五人方法修約。為了縮短數字后面的零數,也可用10的指數表示(見表1)

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