初始污染菌檢驗方法驗證的目的是確保初始污染菌檢驗方法的適用性，從而保證檢驗結果的準確性。初始污染菌的數量可以反映出車間環境衛生的清潔度，與產品滅菌工藝、成品熱原及內毒素有直接關系，故而要對其檢測方法進行驗證，確認其有效性及檢測準確性，從而優化產品滅菌工藝及控制產品熱原及內毒素，確保產品的安全性。

初始污染菌也稱初始生物負載（bioburden）指產品或無菌屏障系統表面或內部的活微生物數量。不同國家對不同產品的生物負載有不同的要求。

初始污染菌檢查時培養基的選擇，醫療器械產品初始污染菌中培養基適用性檢查菌種傳代數不要超過5代，菌種種類目前主要有5種：

大腸埃希菌 ?CMCC(B) 44 102

金黃色葡萄球菌 CMCC(B) 26 003

枯草芽孢桿菌 CMCC(B) 63 501

白色念珠菌CMCC(F) 98 001

黑曲霉菌 CMCC(F) ?98 003

獲取菌種的方法：可從藥檢所采購自行培養稀釋，它的缺點是操作繁瑣，工作量大，菌數不準確。所以目前大多數企業都會選擇商業化的培養基靈敏度指示劑，優點是方便，可以在5min之內完成操作，并且菌數準確。主要步驟是將指示劑進行溶解混勻，取100ul接種，然后培養，所以說操作簡便，菌量準確。

接種數量50-100CFU，不同的培養基接種的微生物種類不同而有所不同。供試品對照組制備：取制備好的供試液100ml， 以稀釋液代替菌液同試驗組操作。

陰性對照組為確認試驗條件是否符合要求所進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長。如陰性對照有菌生長，應進行偏差調查。

樣品份額（SIP)，當整個樣品不可能全部用于無菌檢查時，可用樣品的其中一部分用于無菌檢查。

若不知道產品在微生物的分布，根據材料組成的比例來隨機選擇SIP。

若知道產品上的微生物是均勻分布的，則SIP可以從產品的任意部分選擇。

若知道產品上的微生物分布但分布又不均勻，則SIP可以選擇滅菌過程中*難滅菌的部位，或根據材料組成的比例來隨機選擇SIP。應盡力盡快將試驗樣品移至實驗室。如果必須推遲轉送，在試驗樣品的保存條件應能避免微生物的丟失或改變。應規定貯存*長時間。干燥能成為微生物數量明顯減少的原因，所以在選擇貯存條件和貯存時間時應加以考慮。

計數方法適用性試驗中，采用平皿法或薄膜過濾法時，分為四個組，試驗組、菌液組、供試品對照組、洗脫液對照組。

驗證試驗應進行3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌的每次試驗回收率。試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在0.5～2 范圍內。陰性對照試驗應無菌生長。

測定值

修正系數驗證，修正系數、回收率用于補償無法從產品或培養基中完全去除微生物的數值。對某一特定的技術從產品上移除或培養微生物的能力的測定值。

修正系數=1/回收率。

回收率=（洗脫一次得到的微生物數量/ 接種的微生物數量）×****

回收率=（洗脫一次得到的微生物數量/ 洗脫N得到的微生物總數）×****

方法的回收率≥ 50%（0.5），藥典要求≥70%，應評估產品理化特性、物理的處理方法對微生物的影響，在3次獨立的平行試驗中，回收率均應大于70%，則證明方法有效，若發現回收率低于70%，則應排除干擾，重新驗證，或選擇回收率接近要求的方法和試驗條件進行試驗。

浸提液：0.9%無菌氯化鈉溶液，取至少三個樣品，向單個樣品中加入適量浸提液，充分震搖后收集于已滅菌容器中，即得**次洗脫液。同法洗脫第二次、第三次、第四次。

采用開放式薄膜過濾法，每張濾膜過濾適量供試液，用適量浸提介質沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于培養基上，每個樣品分別接種于胰酪大豆胨瓊脂培養基和沙氏葡萄糖瓊脂培養基各1個。另取浸提介100mL 同法操作，作為陰性對照。以上兩種培養基分別于 35℃和 25℃培養培養5天。

在計數時，分離到以前未遇到過的微生物，則應對其特征進行研究，并對其在生產過程，包括滅菌過程的潛在影響加以考慮和記錄存檔。

初始污染菌計數結果應符合標準規定的限值。應采用用統計學分析的一些結果，如minitab、JMP，其優點為可以發現被隨機誤差和已知的周期性波動，如季節變換所掩蓋的一個細菌污染逐級向上的趨勢。通常微生物的數值在一段時間都保持在一個穩定的水平，然后很短時間內出現一個明顯的尖峰。這個尖峰的出現頻率應該被重點監測，看其頻率的變化情況以及是否符合影響初始污染。

偏差與變更控制，在確認過程中如有不符合法規標準或檢驗的情況發生，實驗員應分析原因，找出原因，進行糾正或改進以達到要求，否則方法不能投入使用。驗證執行中若有對已批準既定方案等變更，以及驗證結束后決定對驗證對象進行必要變更的，必須報上級領導。必要時對可能影響產品質量、安全性或有效性的主要變更進行評估，確定是否需要變更后重新驗證。

參考資料：

《醫療器械生產質量管理規范》

GB/T 19973.1-2015《醫療器械的滅菌微生物學方法 第 1 部分：產品上微生物總數的測定》

《中國藥典》2020 年版四部 1105 非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法

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