細菌內毒素檢查法是利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法。

1、醫療器械細菌內毒素檢驗標準

（1）GB/T 14233.2-2005 醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分：生物學試驗方法[1]；

（2）2015年版《中國藥典》1143 細菌內毒素檢查法 [2]。

2、醫療器械細菌內毒素所需主要設備

（1）電熱干燥箱，溫度達到 250 ℃，用于除外源性內毒素。

（2）旋渦混合器。

（3）試管恒溫儀、恒溫水浴箱或適宜的恒溫器，可設定溫度為（37±1）℃。

（4）天平，精度為 0.1 mg 以下。

（5）鱟試劑，應具有國家主管部門的批準文號。

（6）細菌內毒素國家標準品或細菌內毒素工作標準品，應具有國家主管部門的批準文號。

（7）細菌內毒素檢查用水應符合滅菌注射用水標準，其內毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝膠法）或0.005 EU/ml（用于光度測定法），且對內毒素試驗無干擾作用。

（8）實驗用具：剪刀、砂輪、試管、三角瓶、試管架、洗耳球、封口膜、75% 乙醇棉、時鐘、移液管（或刻度吸管）、凝集管（10 mm×75 mm）、微量加樣器及無熱原吸頭。耐熱器皿須經250℃干烤至少30min。若使用與微量加樣器配套的吸頭等塑料器具時，應選用標明無內毒素并且對試驗無干擾的器械。

3、試驗準備

3.1 玻璃器皿的洗滌將玻璃器皿放入鉻酸洗液中充分浸泡，然后取出將洗液控干，用自來水將殘留洗液徹底洗凈，再用蒸餾水反復沖洗3 遍以上，控干后放入適宜的密閉金屬容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器內，放入電熱干燥箱。

3.2 ?除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內毒素玻璃器皿置電熱干燥箱后，待干燥箱溫度升至250 ℃后開始計時，干烤30 min以上。達到規定時間后，關斷電源，待干燥箱溫度自然降至室溫。

3.3 供試品溶液的制備供試品應使用細菌內毒素檢查用水為浸提介質，一般供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的 pH值為6.0~8.0為宜。采用無熱原氫氧化鈉或鹽酸溶液調節供試液的pH值。無熱原氫氧化鈉或鹽酸溶液須用細菌內毒素檢查用水，在已去除內毒素的容器中配制。也可使用不含內毒素和干擾因子且經過驗證的緩沖液。

4、凝膠法操作方法

用鱟試劑與細菌內毒素產生凝聚反應的機制，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定。如經檢驗證實供試品對細菌內毒素試驗有不能排除的干擾作用則不適宜采用本試驗。本試驗操作過程應防止內毒素的污染。

4.1鱟試劑靈敏度復核

在使用一批新的鱟試劑進行供試品細菌內毒素檢查或供試品干擾試驗前，實驗室必須進行鱟試劑靈敏度復核試驗。目的為考察鱟試劑的靈敏度是否準確，同時也考查檢驗人員操作方法是否正確及試驗條件是否符合規定。

4.1.1細菌內毒素標準溶液的制備(按說明書，略）

4.1.2 待復核鱟試劑的準備(按說明書，略）

4.1.3 加樣(按說明書，略）

4.1.4觀察并記錄結果將試管架從水浴或恒溫器中輕輕取出，避免振動，將每管拿出緩緩倒轉 180°觀察，若管內形成凝膠，并且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為（＋）；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（-）。保溫和拿取試管過程應避免受到振動造成假陰性結果。

4.1.5 試驗結果計算

4.1.6 結果判斷

當λc 在 0.5~2.0 λ（包括 0.5 λ 和 2.0 λ）時判定該批鱟試劑靈敏度復核合格，可用于干擾試驗和供試品細菌內毒素檢查，并以λ（標示靈敏度）為該批鱟試劑的靈敏度。

4.1.7 舉例

4.2干擾試驗

目的是檢驗在某一濃度下的供試品對于鱟試劑與內毒素的反應有無干擾作用。

4.3供試品細菌內毒素檢查[3-4]

在細菌內毒素檢查中，每批供試品必須做2支供試品管和2支供試品陽性對照，同時每次試驗須做2支陽性對照和2支陰性對照。

5、注 意 事 項

（1）試驗前，須用肥皂洗手，用75%乙醇棉球消毒，試驗操作應在清潔環境中進行，過程中應防止內毒素的污染。

（2）在使用洗耳球、移液管取樣時，應注意不要將洗耳球中的氣體吹入溶液中，以防止氣體中的內毒素進入供試液。

（3）試驗所用器具經250℃干烤30min以上，要待烤箱溫度升至250℃后開始計時。在不打開金屬容器的情況下，可在2d內使用；如果玻璃器皿用錫箔紙包裝，在不打開包裝的情況下可在兩周內使用，否則須再次干烤。

（4）開啟細菌內毒素國家標準品或工作標準品、鱟試劑時，先輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%乙醇棉球擦拭后啟開，啟開過程中應防止玻璃碎片落入瓶內。

（5）無菌醫療器械生產企業在生產過程中須嚴格控制產品初始污染菌，以免導致滅菌后產品細菌內毒素指標超過限值。

（6）對于非液態產品企業制定產品技術要求時，如按EU/ml規定細菌內毒素限值在試驗方法中則需明確產品的浸提液體積。

（7）按GB/T14233.2-2005醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第 2部分：生物學試驗方法進行供試品細菌內毒素檢驗時，供試液應在（37±1）℃恒溫箱中浸提不小于 1h，供試液貯存應不超過2h。

（8）溶解鱟試劑及混勻供試品和鱟試劑時，不要劇烈振蕩避免產生氣泡；試驗過程中應注意更換吸頭，以避**查用水的污染及溶液的交叉污染。

（9）由于凝集反應是不可逆的，所以在反應過程中及觀察結果時應注意不要使試管受到振動，以免使凝膠破碎產生假陰性結果。

（10）進行干擾試驗時，標準對照系列和含內毒素的供試品溶液系列應同時進行；如經檢驗證實供試品對細菌內毒素試驗有不能排除的干擾作用則不適宜采用凝膠限度法。

（11）在進行鱟試劑靈敏度復核、干擾試驗和供試品細菌內毒素檢查時，各個試驗中要求的對照應同時進行，并在試驗有效的情況才能進行計算和判斷。

（12）對于一個初包裝內有多組件的成套器械，如規定的內毒素限值是針對成套器械的，可以用一份浸提液對所有組件浸提，也可將各組件分別浸提后混合，各組件所用的浸提液總體積應不超過MVD，當組合后樣品出現結果不確定時，則需分別檢驗各組件，以研究各組件的污染源。

（13）如一個初包裝產品為多個醫療產品的集合，在臨床應用中每種醫療器械獨立使用，則應有各自的產品內毒素限值，且應分別進行試驗和評價。

（14）2015年版《中國藥典》1143細菌內毒素檢查法包括凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結果有爭議時，除另有規定外，以凝膠限度試驗結果為準。

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