作者:百檢網 時間:2022-05-07 來源:互聯網
在植物提取物檢測項目中,抗氧化活性是重要的評價指標之一。抗氧化活性評價主要是通過試驗了解提取物的抗衰老、抗疲勞、抗炎等生物活性的檢測項目。以槐米為例,由于含有豐富的黃酮、皂苷和甾醇等生物活性物質,槐米被公認為是目前*具有抗氧化活性潛力的農業廢棄物之一。槐米中提取的蘆丁,具有良好的抗氧化活性,此外在降血清膽固醇、降血壓、降血脂、降血糖和提高免疫力等多方面具有良好的功效。所以,以槐米為資源開發以蘆丁、槲皮素等為代表的抗氧化活性物質可以廣泛地應用到食品、保健品和藥品工業領域,形成高附加值產品用。因此,抗氧化活性也就成為評價植物提取物產品開發和質量控制的關鍵指標之一。
主流抗氧化活性評價方法介紹
目前,植物提取物中抗氧化活性評價方法主要根據受試對象可以分為體內法和體外法二大類。體內方法以丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱苷肽等為指標,測定其含量來評價體內抗氧化活性的高低。體外抗氧化評價體系則以自由基清除法、氧化還原法為主。體內方法的優勢是更接近人體結果,但一般費時費力,且只能反映某一指標活性的高低。體外方法則很好地彌補了體內法的缺點。其中,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法是應用*廣泛的抗氧化測定方法。
必須注意的是,常規的比色皿模式的 DPPH 測定法將DPPH 溶液與樣品直接混合,因此檢測得到的是樣品總的抗氧化活性。然而,植物提取物原料通常是多元抗氧化活性物質混合物。當這些物質混合在一起被 DPPH 法測定的時候,相互之間可能存在抗氧化拮抗或協同的效應,導致檢測評估結果偏低或者偏高。
此外,在很多評價任務中,僅僅測定混合物樣品的總抗氧化性常規的抗氧化活性評價方法基于DPPH 分子與自由基混合后體系的顏色變化,利用紫外-可見分光光度計監測其吸光度值變化可以實現對樣品中總抗氧化活性的定量分析。但必須注意的是,這種抗氧化評價方法有一個固有的缺點:檢測選擇性差。更確切地說,當樣品中含有兩種或者兩種以上的抗氧化活性物質的時候,分析結果無法區分每一種物質的抗氧化活性高低。
薄層色譜法介紹
薄層色譜法是建立在薄層色譜和 DPPH 顯色反應聯用基礎上的抗氧化分析方法,因為兼備選擇性高和通用性好的優點,所以近年來廣泛應用到植物提取物分析的一項色譜分離技術。與柱色譜的閉環工作原理不同,薄層色譜是一個去中心化、開放的分析系統,分離過程結束后分離結果被保留在色譜板上而非廢液瓶中。這一獨特的優勢使得薄層色譜的分離結果可以方便地與很多無法與傳統柱色譜系統兼容的檢測手段實現無障礙融合。因此,薄層色譜不僅是一種通量大、操作簡便和靈活性高的色譜工具,而且還可以作為多種離線檢測方法高效集成融合的分析平臺,在分析通量、簡便性、精密度和適用范圍等方面達到了較為理想的平衡,因此在植物提取物活性評價方面有良好的應用前景。
更重要的是,薄層色譜法是目前**能與生化反應直接聯用的色譜工具。和傳統的試管法測試不同,薄層色譜的色譜分離結果開放性和反應載體功能可以從根本上解決基于 DPPH 變色反應的抗氧化評估方法選擇性差的問題。薄層分離使原本混在一起的不同抗氧化物質按分子結構的差異移動到薄層板上不同的位置形成物理隔離,因而可以有效避免各種物質之間可存在的協同或拮抗效應;隨后,通過浸漬方式與薄層板耦合的 DPPH 溶液可以方便地實現對混合物中不同抗氧化組分的同時評估。因此,相對于傳統的方法,建立在薄層色譜和 DPPH 顯色反應基礎上的抗氧化評價方法更加可靠。
目前,薄層色譜法已發展具備一整套完整的儀器化操作平臺,在點樣、展開、浸漬衍生和掃描定量過程中均實現了半自動甚至全自動化,顯著擴展了應用范圍。其中,半自動薄層點樣儀在高壓氮氣流的協助下,點樣針內的液體樣品以*細的液流形式被吹掃至色譜板上,點樣體積通常在 1~10 μL 范圍內。通過非接觸吹 掃法進行條帶狀點樣,可以顯著提高分離后相鄰斑點的分辨率。薄層色譜分析過程中,所有步驟獨立并配備相對應設備,可同時進行操作和分析,不僅提高了工作效率,也增加了儀器選擇的靈活性。儀器化的操作平臺在很大程度上提高了色譜分離的靈敏度及色譜展開圖的分辨率,同時可視化成像后的光密度掃描提高了結果的準確性和重現性。
薄層色譜法要點分析
采用薄層色譜法來評價植物提取物的抗氧化活性,主要是利用硅膠薄層色譜對槐米提取物的甲醇溶液進行展開,實現對其中多種抗氧化物質的色譜分離,然后通過浸漬的方式將停留在硅膠薄層上的分離結果與 DPPH 顯色反應相耦合,顯色反應結果用光密度掃描儀定量檢測,檢測結果以蘆丁為內標加權定量計算評估槐米樣品綜合抗氧化能力。我們可以通過分析代表性抗氧化活性化合物的分子結構特點,來優化色譜分離和 DPPH 顯色等關鍵技術參數。
該方法的要點有:
(1)以甲醇為溶劑提取槐米提取物中的抗氧化活性成分
(2)通過超聲進行輔助提取
(3)采用硅膠薄層板為固定相
(4)乙酸乙酯+乙酸+甲酸+水 10+1.1+1.1+2 mL 為流動相
(5)浸漬 DPPH 溶液顯色 15 分鐘
(6)熒光模式,D2&W 燈,激發光波長 530 nm,無濾光片,狹縫尺寸 3.00 × 0.30 mm (Micro),掃描速度 100 mm/s, 數據分辨率 100 μm/step。
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