植物酶屬于飼料添加劑檢測常見產品之一。植物酶可以提高動物的消化功能,催化機體內的生化反應,促進機體的新陳代謝,從而彌補因應激等原因消化酶分泌的減少。所以很多時候,類似植酸酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶、果膠酶、淀粉酶等植物酶制劑會被作為很好的飼料添加劑,應用在飼料產品的生產加工里面。這時候,如果企業能夠準確的把握酶活性、酶反應的相關數據就能夠更好的設計一款符合市場需求的畜禽飼料。
一、方法原理分析
使用分光光度法檢測植酸酶活性,原理主要是利用植酸酶在一定溫度和 pH 條件下,可以水解底物植酸鈉,從而生成正磷酸和肌醇衍生物,只要在酸性溶液中,用釩鉬酸氨處理,就會生成黃色的【( NH4) 3PO 4 NH 4 VO 3 · 16M O O 3 】復合物,然后我們用分光光度計,在波長 415nm 下進行比色測定就可以了解其酶活性。
二、檢測方法步驟
1.取有代表性樣品, 用四分法將試樣縮分至200g, 植酸酶產品不需粉碎, 配合飼料和添加劑預混合飼料需粉碎通過0.45mm標準篩,裝入密封容器,防止試樣成分變化。
2.稱取樣品5000U/g的0.4——0.6g,精確至0.0001g,置于250mL三角瓶中,準確加入100mL乙酸緩沖液(2),放到空氣浴搖床上振蕩30min或磁力攪拌器上高速攪拌30min,在離心機上以4000r/min離心10min。分取不同體積的上清液用乙酸緩沖液(2)稀釋,使樣液濃度保持在0.4U/mL左右,待反應。建議精確移取上清液1mL至25mL容量瓶中,用乙酸緩沖液(2)定容,搖勻。再繼續精確移取1mL試液至25mL容量瓶中,定容,搖勻,稀釋至31250倍。
3.取10mL試管,精確移取2mL稀釋液至試管中,同時做試樣空白。將樣品放入37℃水浴鍋預熱5min,先將空白加4mL終止液(1.3.7),再將樣與空白依次加入4mL底物植酸鈉(1.3.3),從加底物開始,向每支試管中加入試劑的時間間隔要**一致,加液后立即混勻,將其放入37℃水浴水解30min;取出后將樣品各加入4mL終止液。
4.反應后的試樣在室溫下靜置10min,如出現混濁需在離心機(1.4.7)上以4000轉/min離心10min,上清液以標準曲線的空白調零在分光光度計415nm波長處測定樣品空白(A0)和樣品溶液(A)的吸光值,A-A0為實測吸光值,用直線回歸方程計算植酸酶的活性。
三、酶反應分析
1.酶反應的*適溫度
酶反應的*適溫度調節恒溫水浴鍋,在不同溫度下(15——70℃)進行酶促反應。以*高酶活為****,其他條件下的酶活占*高酶活的百分數即為該酶在此溫度條件的相對酶活。植酸酶作為一種酶制劑,對溫度非常敏感,溫度低會降低它的生物活性;溫度高也會降低其生物活性,甚至完全失活。植酸酶隨著溫度的增加,酶活呈上升趨勢,到55℃左右酶活達到*高,溫度超過55℃后酶活開始下降,通過檢測,該酶的*適反應溫度為55℃。
2.酶反應的*適pH值
配制0.1mol的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液,在不同的pH值((1.0——7.0)下進行酶促反應。以*高酶活為****,其他條件下的酶活占*高酶活的百分數即為該酶在此pH條件的相對酶活。通過檢測可知,植酸酶的*適pH值在4.0左右。pH值在2.5——5.5,能保持70%以上的酶活,該酶有較寬的pH適宜范圍,可以在消化道內充分發揮作用。
3.底物濃度對酶活的影響
配制不同反應濃度(0.1——5.0mmol/L)的底物,在常規條件下測定酶活,以*高酶活為****,在其他條件下的酶活,占*高酶活的百分數即為該酶在此底物濃度下的相對酶活。隨著底物濃度的增加酶活逐漸上升,當底物濃度足夠大時,酶全部被底物所飽和,此時反應速度達到*大值。隨著底物濃度的增加,樣品空白的本底值逐漸增大,會影響酶活的測定。
四、總結
通過分光光度計法檢測,我們可以了解到該酶制劑樣品的*適反應溫度為 55℃;*適反應pH值為4.0。酶活的測定在飼料用酶制劑產品的質量檢驗、產品標簽和酶活保證方面是必不可少的項目, 而酶活的測定是一種非常細致的工作,所以,我們一定要找準依據標準,深刻理解影響酶制劑酶活測定的主要因素,正確把握各影響因素的關鍵點,從而才能為企業篩選優質酶制劑、確定復合酶制劑的*佳組方及確定產品的添加量等提供更好的數據支撐。
除了GB/T 18634-2009外,如果想檢測其他植物酶活性,參考的標準還有 GB/T 23874-2009 《飼料添加劑木聚糖酶活力的測定 分光光度法 》、 GB/T 28715-2012《飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定 分光光度法》、 GB/T 33409-2016 《β-半乳糖苷酶活性檢測方法 分光光度法》、 GB/T 23881-2009 《 飼用纖維素酶活性的測定 濾紙法》 等等,大家可酌情參考。
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