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pcr檢測原理

作者:Lance 時間:2022-09-01 來源:互聯網

聚合酶鏈式反應(PCR)是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,PCR的*大特點是能將微量的DNA大幅增加。因此,無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液,只要能分離出一丁點的DNA,就能用PCR加以放大,進行比對。這也是“微量證據”的威力之所在。由1983年美國Mullis**提出設想,1985年由其發明了聚合酶鏈反應,即簡易DNA擴增法,意味著PCR技術的真正誕生。到如今2013年,PCR已發展到第三代技術。1976年,中國科學家錢嘉韻,發現了穩定的Taq DNA聚合酶,為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈,低溫(經常是60°C左右)時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合,再調溫度至DNA聚合酶*適反應溫度(72°C左右),DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實際就是一個溫控設備,能在變性溫度,復性溫度,延伸溫度之間很好地進行控制。

PCR原理

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,在DNA聚合酶的參與下,根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發現,DNA在高溫時也可以發生變性解鏈,當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復性,加入設計引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。但是,DNA聚合酶在高溫時會失活,因此,每次循環都得加入新的DNA聚合酶,不僅操作煩瑣,而且價格昂貴,制約了PCR技術的應用和發展。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發現對于PCR的應用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個循環加酶,使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,PCR技術得以大量應用,并逐步應用于臨床。PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成:①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;③引物的延伸:DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基互補配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈,重復循環變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

檢測

PCR反應擴增出了高的拷貝數,下一步檢測就成了關鍵。熒光素(溴化乙錠,EB)染色凝膠電泳是*常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的,因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行,成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法,有逐漸取代電泳法的趨勢。 [5]

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