目的

檢測(cè)生產(chǎn)車(chē)間空氣、操作人員手部、與食品有直接接觸面的機(jī)械設(shè)備的微生物指標(biāo)，生產(chǎn)區(qū)域環(huán)境當(dāng)中病原微生物的監(jiān)控，達(dá)到規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，以控制食品成品的質(zhì)量。

一、參考標(biāo)準(zhǔn)

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB 15979-2002、《HACCP原理與實(shí)施》、中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《公共場(chǎng)所空氣微生物檢驗(yàn)方法細(xì)菌總數(shù)測(cè)定》GB/T 18204.1-2013、出入境檢驗(yàn)檢疫局2004年《出入食品微生物檢驗(yàn)培訓(xùn)教材》中《出入食品生產(chǎn)廠衛(wèi)生細(xì)菌檢驗(yàn)方法》、日本東京冷凍食品檢驗(yàn)方法。

二、采樣與檢測(cè)方法

A.空氣的采樣與測(cè)試方法

1.樣品采集：

取樣頻率：

a.車(chē)間轉(zhuǎn)換不同衛(wèi)生要求的產(chǎn)品時(shí)，在加工前進(jìn)行采樣，以便了解車(chē)間衛(wèi)生清掃消毒情況。

b.全廠統(tǒng)一放長(zhǎng)假后，車(chē)間生產(chǎn)前，進(jìn)行采樣。

c.產(chǎn)品檢驗(yàn)結(jié)果超內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)及時(shí)對(duì)車(chē)間進(jìn)行采樣，如有檢驗(yàn)不合格點(diǎn)，整改后再進(jìn)行采樣檢驗(yàn)。

d.實(shí)驗(yàn)性新產(chǎn)品，按客戶規(guī)定頻率采樣檢驗(yàn)。

e.正常生產(chǎn)狀態(tài)的采樣，每周一次。

2.采樣方法

在動(dòng)態(tài)下進(jìn)行，室內(nèi)面積不超過(guò)30m2，在對(duì)角線上設(shè)里、中、外三點(diǎn)，里、外點(diǎn)位置距墻1m;室內(nèi)面積超過(guò)30m2，設(shè)東、西、南、北、中五點(diǎn)，周?chē)?點(diǎn)距墻1m。采樣時(shí)，將含平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基的平板(直徑9cm)置采樣點(diǎn)(約桌面高度)，并避開(kāi)空調(diào)、門(mén)窗等空氣流通處，打開(kāi)平皿蓋，使平板在空氣中暴露5min。采樣后必須盡快對(duì)樣品進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)，送檢時(shí)間不得超過(guò)4h，若樣品保存于0～4℃條件時(shí)，送檢時(shí)間不得超過(guò)24h。

3.菌落培養(yǎng)：

a.在采樣前將準(zhǔn)備好的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基平板置36℃±1℃ 培養(yǎng)24h，取出檢查有無(wú)污染，將污染培養(yǎng)基剔除。

b.將已采集樣品的培養(yǎng)基在4h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，菌落總數(shù)于36℃±1℃培養(yǎng)48h觀察結(jié)果，計(jì)數(shù)平板上細(xì)菌菌落數(shù)。

4.菌落計(jì)算：

a.記錄平均菌落數(shù)，用“CFU/皿”來(lái)報(bào)告結(jié)果。用肉眼直接計(jì)數(shù)，標(biāo)記或在菌落計(jì)數(shù)器上點(diǎn)計(jì)，然后用5～10倍放大鏡檢查，不可遺漏。

b.若培養(yǎng)皿上有2個(gè)或2個(gè)以上的菌落重疊，可分辨時(shí)仍以2個(gè)或2個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)。

B.工作臺(tái)(機(jī)械器具)表面與工人手表面采樣與測(cè)試方法：

1.樣品采集：

①取樣頻率：

a.車(chē)間轉(zhuǎn)換不同衛(wèi)生要求的產(chǎn)品時(shí)，在加工前進(jìn)行擦拭檢驗(yàn)，以便了解車(chē)間衛(wèi)生清掃消毒情況。

b.全廠統(tǒng)一放長(zhǎng)假后，車(chē)間生產(chǎn)前，進(jìn)行全面擦拭檢驗(yàn)。

c.產(chǎn)品檢驗(yàn)結(jié)果超內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)及時(shí)對(duì)車(chē)間可疑處進(jìn)行擦拭，如有檢驗(yàn)不合格點(diǎn)，整改后再進(jìn)行擦拭檢驗(yàn)。

d.實(shí)驗(yàn)新產(chǎn)品，按客戶規(guī)定擦拭頻率擦拭檢驗(yàn)。

e.對(duì)工作表面消毒產(chǎn)生懷疑時(shí)，進(jìn)行擦拭檢驗(yàn)。

f.正常生產(chǎn)狀態(tài)的擦拭，每周一次。

②采樣方法：

a.工作臺(tái)(機(jī)械器具)：用浸有滅菌生理鹽水的棉簽在被檢物體表面(取與食品直接接觸或有一定影響的表面)取25cm2的面積，在其內(nèi)涂抹10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)送檢。

b.工人手：被檢人五指并攏，用浸濕生理鹽水的棉簽在右手指曲面，從指尖到指端來(lái)回涂擦10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)送檢。

③采樣注意事項(xiàng)：

擦拭時(shí)棉簽要隨時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)，保證擦拭的準(zhǔn)確性。對(duì)每個(gè)擦拭點(diǎn)應(yīng)詳細(xì)記錄所在分場(chǎng)的具體位置、擦拭時(shí)間及所擦拭環(huán)節(jié)的消毒時(shí)間。

2.細(xì)菌·大腸菌群的檢測(cè)培養(yǎng):

樣液稀釋?zhuān)簩⒎庞忻薨舻脑嚬艹浞终駬u。此液為1：10稀釋液。如污染嚴(yán)重，可十倍遞增稀釋?zhuān)?ml 1：10樣液加9ml無(wú)菌生理鹽水中，混勻，此液為1：100稀釋液。

(1)菌落總數(shù)：

a.以無(wú)菌操作，選擇1～2個(gè)稀釋度各取1ml樣液分別注入到無(wú)菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿(平行樣)，將已融化冷至45℃左右的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾入平皿，每皿約15~20ml，充分混合。

b.待瓊脂凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，置36℃±1℃ 培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

c.結(jié)果報(bào)告：報(bào)告每25cm2食品接觸面中或每只手的菌落數(shù) 。

(2)大腸菌群：

①平板法:

a.以無(wú)菌操作，選擇1～2個(gè)稀釋度各取1ml樣液分別注入到無(wú)菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿(平行樣)，將VRBA培養(yǎng)基傾入平皿，每皿約15~20ml，充分混合。待瓊脂凝固后,再覆蓋一層培養(yǎng)基，約3-5 ml。

b.待瓊脂凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，置36℃±1℃ 培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)。

c.證實(shí)實(shí)驗(yàn)：從VRBA平板上挑取典型和可疑菌落接種BGLB進(jìn)行證實(shí)實(shí)驗(yàn)。

d. 結(jié)果計(jì)算：經(jīng)*后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以平板上出現(xiàn)的典型和可疑菌落個(gè)數(shù)乘以稀釋倍數(shù)得出。

e.結(jié)果報(bào)告：報(bào)告每25cm2食品接觸面中或每只手的菌落數(shù)。

②MPN法:

a. 以無(wú)菌操作，選擇3個(gè)稀釋度各取1ml樣液分別接種到LST肉湯培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋度接種三管。

b.置LST肉湯管于36℃±1℃培養(yǎng)48±2h。記錄所有LST肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù)。

c.選擇產(chǎn)氣渾濁的發(fā)酵管接種BGLB進(jìn)行復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

d.結(jié)果報(bào)告：按BGLB肉湯管產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表報(bào)告每25cm2食品接觸面中或每只手的大腸菌群值。

(3)金黃色葡萄球菌檢測(cè)

①定性檢測(cè)

a.取1ml 稀釋液注入滅菌的平皿內(nèi)，傾注15-20ml的B-P培養(yǎng)基，(或是吸取0.1稀釋液，用L棒涂布于表面干燥的B-P瓊脂平板)，放進(jìn)36±1℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2小時(shí)。

b.從每個(gè)平板上至少挑取1個(gè)可疑金黃色葡萄球菌的菌落作血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)。

c.結(jié)果報(bào)告：B-P瓊脂平板的可疑菌落作血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性，即報(bào)告手(工器具)上有金黃色葡萄球菌存在。

②定量檢測(cè)

a.以無(wú)菌操作，選擇3個(gè)稀釋度各取1ml樣液分別接種到含7.5﹪氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋度接種三管。

b.置肉湯管于36±1℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)。劃線接種于表面干燥的B-P瓊脂平板，置36℃±1℃ 培養(yǎng)45～48小時(shí)。

c.從B-P瓊脂平板上，挑取典型或可疑金黃色葡萄球菌菌落接種肉湯培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)20～24小時(shí)。

d.取肉湯培養(yǎng)物做血漿凝固酶試驗(yàn)，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

e.報(bào)告結(jié)果：根據(jù)凝固酶試驗(yàn)結(jié)果，查MPN表報(bào)告每25 cm2食品接觸面中或每只手的金黃色葡萄球菌值。

C.工廠環(huán)境中病原體的檢測(cè)計(jì)劃與方法

檢測(cè)計(jì)劃：為了保證食品安全，工廠應(yīng)該對(duì)生產(chǎn)環(huán)境中的病原微生物進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)估，檢測(cè)項(xiàng)目包括李斯特菌，沙門(mén)氏菌等病原體微生物，化驗(yàn)室應(yīng)該按照一定的計(jì)劃對(duì)生產(chǎn)場(chǎng)所環(huán)境中的病原體進(jìn)行檢測(cè)，其中包括地面、下水道、 排水溝、墻壁、天花板、設(shè)備框架、運(yùn)輸?shù)闹Ъ埽洳匮b置、速凍機(jī)、傳送帶、設(shè)備的螺絲、維修工具等部位。當(dāng)某個(gè)點(diǎn)檢測(cè)到病員微生物時(shí)，應(yīng)該對(duì)環(huán)境中的相似點(diǎn)加大檢測(cè)頻率;在把所有的預(yù)定點(diǎn)檢測(cè)完后，應(yīng)該對(duì)環(huán)境中的病原微生物的存在狀況進(jìn)行全面評(píng)估，在下一次環(huán)境檢測(cè)循環(huán)過(guò)程中加強(qiáng)檢測(cè)容易出現(xiàn)病原體的環(huán)境點(diǎn)，達(dá)到持續(xù)改進(jìn)的目的。

檢測(cè)頻率: 每月兩次,每次每個(gè)區(qū)域至少選取5個(gè)檢測(cè)點(diǎn),分別進(jìn)行檢測(cè)。

1.環(huán)境李斯特菌的檢測(cè)方法(3MTM PetrifilmTM 環(huán)境李斯特菌的測(cè)試片)

(1)用涂抹棒，海綿或者其他采樣設(shè)備收集環(huán)境樣本。

(2) 將收集的樣本添加10毫升滅菌的緩沖蛋白胨水，將樣本與緩沖蛋白胨混合1分鐘，將樣品置于室溫(20-30℃)1小時(shí)，*久不超過(guò)1.5小時(shí)，以修復(fù)損傷的李斯特菌。

(3) 將測(cè)試片放在平坦處，掀起上層膜。

(4) 用移液器垂直滴加3毫升樣品到下層膜中央，將上層膜緩慢蓋下，以免產(chǎn)生氣泡。

(5) 輕輕將塑料壓板放在位于接種區(qū)上層膜上，不要壓，扭轉(zhuǎn)或者滑動(dòng)壓板。提起壓板等至少十分鐘，以使膠體凝固。

(6) 將測(cè)試片透明面朝上，可疊放至十片，在37℃±1℃培養(yǎng)26-30小時(shí)，可以用標(biāo)準(zhǔn)菌落記數(shù)器或者其他光學(xué)放大器判讀，不要記數(shù)圓形輪廓上的菌落，因?yàn)樗麄儾皇苓x擇性培養(yǎng)基的影響。

(7) 對(duì)于定性檢測(cè)，根據(jù)紫紅色菌落是否存在，結(jié)果記為檢出或者未檢出。

2.環(huán)境中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)方法

(1)采樣地點(diǎn): 選取采樣點(diǎn)時(shí)因盡量選取微生物容易滋生的地方。

(2)操作步驟

a.采樣應(yīng)在生產(chǎn)開(kāi)始后進(jìn)行，用已浸潤(rùn)過(guò)的棉拭在選定的被測(cè)表面旋轉(zhuǎn)涂抹約100cm2的面積，然后將棉拭放回涂抹試管并蓋緊。

b.將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，每5個(gè)點(diǎn)混合成一個(gè)樣品, 登記編號(hào),按照標(biāo)準(zhǔn)及時(shí)檢測(cè)，若有陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)，應(yīng)逐步對(duì)所混合的每個(gè)點(diǎn)分別檢測(cè)。