作者:小強 時間:2022-10-20 來源:互聯網
食品產氣莢膜梭菌怎么檢測?目前對于食品產氣莢膜梭菌有對應的檢測方法標準依據。今天百檢網就給大家介紹一下食品產氣莢膜梭菌的測定方法相關信息。
檢測方法標準依據:GB 4789.13-2012 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 產氣莢膜梭菌檢驗
1.范圍
本標準規定了食品中產氣莢膜梭菌( Clostridium perfringens)的檢驗方法。
本標準適用于食品中產氣莢膜梭菌的檢驗。
2.設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下:
a) 恒溫培養箱:36℃±1℃;
b) 冰箱:2℃~5℃;
c) 恒溫水浴箱:50℃±1℃,46℃±0.5℃;
d) 天平:感量0.1g;
e) 均質器;
f) 顯微鏡:10×~100×;
g) 無菌吸管:1mL(具0.0lmL刻度)、10mL(具0.lmL刻度)或微量移液器及吸頭;
h) 無菌試管:18mmx180mm;
i) 無菌培養皿:直徑90mm;
j) pH計或pH比色管或精密pH試紙;
k) 厭氧培養裝置。
3.培養基和試劑
3.1 胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸(TSC)瓊脂:見附錄A中A.1。
3.2 液體硫乙醇酸鹽培養基(FTG):見附錄A中A.2。
3.3 緩沖動力-硝酸鹽培養基:見附錄A中A.3。
3.4 乳糖-明膠培養基:見附錄A中A4。
3.5 含鐵牛乳培養基:見附錄A中A5。
3.6 0.1%蛋白胨水:見附錄A中A.6。
3.7 革蘭氏染色液:見附錄A中A.7。
3.8 硝酸鹽還原試劑:見附錄A中A8。
3.9 緩沖甘油-氯化鈉溶液:見附錄A中A.9。
4.檢驗程序
產氣莢膜梭菌檢驗程序見圖1。
5.操作步驟
5.1 樣品制備
5.1.1 樣品采集后應盡快檢驗,若不能及時檢驗,可在2℃~5℃保存;如8h內不能進行檢驗,應以無菌操作稱取25g(mL)樣品加入等量緩沖甘油-氯化鈉溶液(液體樣品應加雙料),并盡快至于-60℃低溫冰箱中冷凍保存或加干冰保存。
5.1.2 以無菌操作稱取25g(mL)樣品放入含有225mL0.1%蛋白胨水(如為51.1中冷凍保存樣品,室溫解凍后,加入200mL0.1%蛋白胨水)的均質袋中,在拍擊式均質器上連續均質1min~2min;或置于盛有225mL0.1%蛋白胨水的均質杯中,8000r/min~10000rmin均質1min~2min,作為1:10稀釋液。
5.1.3 以上述1:10稀釋液按1mL加0.1%蛋白胨水9mL制備10-2~10-6的系列稀釋液。
5.2 培養
5.2.1 吸取各稀釋液1mL加入無菌平皿內,每個稀釋度做兩個平行。每個平皿傾注冷卻至50℃的TSC瓊脂(可放置于50℃±1℃恒溫水浴箱中保溫)15mL,緩慢旋轉平皿,使稀釋液和瓊脂充分混勻。
5.2.2 上述瓊脂平板凝固后,再加10mL冷卻至50℃的TSC瓊脂(可放置于50℃±1℃恒溫水浴箱中保溫)均勻覆蓋平板表層。
5.2.3 待瓊脂凝固后,正置于厭氧培養裝置內,36℃±1℃培養20h~24h。
5.2.4 典型的產氣莢膜梭菌在TSC瓊脂平板上為黑色菌落。
5.3 確證試驗
5.3.1 從單個平板上任選5個(小于5個全選)黑色菌落,分別接種到FTG培養基,36℃±1℃培養18h~24h
5.3.2 用上述培養液涂片,革蘭氏染色鏡檢并觀察其純度。產氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性粗短的桿菌,有時可見芽孢體。如果培養液不純,應劃線接種TSC瓊脂平板進行分純,36℃±1℃厭氧培養20h~24h挑取單個典型黑色菌落接種到FTG培養基,36℃±1℃培養18h~24h,用于后續的確證試驗。
5.3.3 取生長旺盛的FTG培養液1mL接種于含鐵牛乳培養基,在46℃±0.5℃水浴中培養2h后,每小時觀察一次有無“暴烈發酵”現象,該現象的特點是乳凝結物破碎后快速形成海綿樣物質,通常會上升到培養基表面。5h內不發酵者為陰性。產氣莢膜梭菌發酵乳糖,凝固酪蛋白并大量產氣,呈“暴烈發酵”現象,但培養基不變黑。
5.3.4 用接種環(針)取FrG培養液穿刺接種緩沖動力-硝酸鹽培養基,于36℃±1℃培養24h。在透射光下檢査細菌沿穿刺線的生長情況,判定有無動力。有動力的菌株沿穿刺線呈擴散生長,無動力的菌株只沿穿刺線生長。然后滴加0.5mL試劑甲和0.2mL試劑乙以檢査亞硝酸鹽的存在。15min內出現紅色者,表明硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽;如果不岀現顏色變化,則加少許鋅粉,放置10min,出現紅色者,表明該菌株不能還原硝酸鹽。產氣莢膜梭菌無動力,能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。
5.3.5 用接種環(針)取FTG培養液穿刺接種乳糖-明膠培養基,于36℃±1℃培養24h,觀察結果如發現產氣和培養基由紅變黃,表眀乳糖被發酵并產酸。將試管于5℃左右放置1h,檢査明膠液化情況。
如果培養基是固態,于36℃±1℃再培養24h,重復檢査明膠是否液化。產氣莢膜梭菌能發酵乳糖,使明膠液化。
………………
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