HJ 1190-2021 水質(zhì) 滅菌生物指示物（枯草芽孢桿菌 黑色變種）的鑒定 生物學(xué)檢測法

警告：檢測人員應(yīng)采取必要的生物安全防護措施（包括但不僅限于一次性手套、口罩、防護服、防護眼鏡、鞋套等防護用品）；檢測時應(yīng)做好無菌防護，在無菌操作設(shè)備內(nèi)進行。

1 適用范圍

本標準規(guī)定了鑒定水中滅菌生物指示物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的生物學(xué)方法。

本標準適用于微生物實驗室滅菌效果的評價。

2 規(guī)范性引用文件

本標準引用了下列文件或其中的條款。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本標準。凡是未注日期的引用文件，其新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。

《消毒技術(shù)規(guī)范》（原衛(wèi)生部衛(wèi)法監(jiān)發(fā)〔2002〕282 號）

3 術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標準。

3.1

枯草芽孢桿菌黑色變種 Bacillus subtilis var. niger

也稱萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus），在含酪氨酸的培養(yǎng)基上形成黑色素的革蘭氏陽性芽孢桿菌。作為滅菌效果評價試驗的指示菌種。

3.2

滅菌 sterilization

物理或化學(xué)的方法殺滅全部微生物，包括致病和非致病微生物、芽孢和朊病毒蛋白，使之達到無菌保障水平。常用的滅菌方法有化學(xué)試劑滅菌（如環(huán)氧乙烷、甲醛等）、射線滅菌（如γ射線、電子束輻射等）、濕熱滅菌、干熱滅菌和過濾除菌等。

3.3

生物指示物 biological indicator

含有對特定滅菌過程具有一定耐受力的活微生物的生物制品。

注：生物指示物為特定滅菌過程是否滿足殺滅指定數(shù)量微生物的必須條件提供信息，并規(guī)定該過程的置信水平。

4 方法原理

經(jīng)滅菌處置后含枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢的水樣通過孔徑為 0.45 μm 的濾膜過濾，細菌和芽孢被截留在濾膜上，然后將濾膜置于酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基上，36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 72 h～96 h，枯草芽孢桿菌黑色變種產(chǎn)生的酪氨酸酶可分解并利用酪氨酸形成黑色素，產(chǎn)生黑色的特征菌落。對特征菌落進行染色鏡檢后通過生化試驗做進一步鑒定，能利用甘油和甘露糖，可還原硝酸鹽和水解淀粉，不能利用苦杏仁苷和甘露醇，并確認為革蘭氏陽性芽孢桿菌的特征菌落為枯草芽孢桿菌黑色變種，鑒定結(jié)果為陽性。

5 試劑和材料

除非另有說明，分析時均使用符合國家標準的分析純試劑，實驗用水為蒸餾水。

5.1 酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基，見附錄 A.1。

5.2 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，見附錄A.2。

5.3 淀粉培養(yǎng)基和碘液，見附錄 A.3。

5.4 硝酸鹽還原培養(yǎng)基和相關(guān)試劑，見附錄A.4。

5.5 甘油復(fù)紅肉湯培養(yǎng)基，見附錄A.5。

5.6 甘露糖生化培養(yǎng)基，見附錄 A.6。

5.7 甘露醇生化培養(yǎng)基，見附錄 A.6。

5.8 苦杏仁苷生化培養(yǎng)基，見附錄A.7。

5.9 革蘭氏染色液，見附錄 A.8。

5.10 芽孢染色液，見附錄 A.9。

5.11 陰性對照菌：如地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

5.12 陽性對照菌：枯草芽孢桿菌黑色變種（Bacillus subtilis var. niger）。

5.13 枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液：按照《消毒技術(shù)規(guī)范》2.1.1.2.3（2）的規(guī)定制備，也可購買濃度范圍在 106 CFU/ml～109 CFU/ml 之間的市售枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液。

5.14 無菌濾膜：直徑 50 mm，孔徑 0.45 μm 的醋酸纖維濾膜。

按無菌操作要求包扎，經(jīng) 121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min，晾干備用；或?qū)V膜放入燒杯中，加入實驗用水，煮沸滅菌 3 次，15 min/次，前 2 次煮沸后需換水洗滌 2～3 次。也可采用市售的無菌濾膜。

5.15 石蠟質(zhì)封口膜。

5.16 無菌水：取適量實驗用水，經(jīng) 121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min，備用。

注 1：5.1～5.10 的成分及制備方法見附錄 A，也可使用市售商品化培養(yǎng)基或染色液；

注 2：5.11～5.12，建議購買由國內(nèi)或國際菌種保藏機構(gòu)保藏的遺傳學(xué)特性得到確認和保證并可追溯的標準菌株。

6 儀器和設(shè)備

6.1 樣品瓶：螺口帶蓋或磨口具塞的 250 ml、500 ml 廣口玻璃瓶。

6.2 恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃±1 ℃。

6.3 高壓蒸汽滅菌器：121 ℃，可調(diào)。

6.4 pH 計：準確到 0.1 pH 單位或更高精度。也可使用 pH 精密試紙。

6.5 顯微鏡：物鏡 4×或 5×、10×、20×、40×，油鏡 100×，目鏡 10×或 15×。

6.6 分析天平：實際分度值 0.0001g。

6.7 培養(yǎng)皿：直徑 90 mm。

6.8 過濾裝置：配有砂芯濾器、圓筒形玻璃漏斗和真空泵，抽濾壓力不低于-50 kPa。

6.9 接種環(huán)：直徑 1 mm～3 mm。

6.10 鑷子：不銹鋼或一次性無菌塑料鑷子。

6.11 刻度移液管：1 ml、10 ml。也可使用可調(diào)式移液器。

6.12 量筒：100 ml。

6.13 錐形瓶：100 ml。

6.14 酒精燈。

6.15 試管：10 ml。

6.16 無菌操作設(shè)備：無菌室、超凈工作臺、生物安全柜。

6.17 一般實驗室常用儀器和設(shè)備。

注：試驗前，移液管、樣品瓶、培養(yǎng)皿、錐形瓶、試管、砂芯濾器、圓筒形玻璃漏斗等玻璃器皿應(yīng)按無菌操作要求包扎，高壓蒸汽滅菌器（6.3）中 121℃滅菌 20 min，烘干，備用。也可采用干熱滅菌（135℃～140 ℃滅菌 3 h～5 h，或 160℃～170℃滅菌 2 h～4 h，或 180℃～200℃滅菌 0.5h～1h）。

7 樣品

7.1 樣品采集

7.1.1 評價使用高溫高壓滅菌設(shè)備的滅菌效果時，取樣品瓶（6.1），加入枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液（5.13）及 200 ml 無菌水（5.16）使混合液中枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢終濃度達到 5×104 CFU/ml～ 5×105 CFU/ml。滅菌處置完畢后，取出樣品瓶，對水樣進行滅菌生物指示物（枯草芽孢桿菌黑色變種） 的檢測。

7.1.2 評價使用其它滅菌設(shè)備的滅菌效果時，滅菌前取適量枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液（5.13）加入滅菌設(shè)備，使水樣中枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢終濃度達到 5×104 CFU/ml～5×105 CFU/ml。滅菌處置完畢后，從滅菌設(shè)備中采集水樣，進行滅菌生物指示物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的檢測。采樣量一般為樣品瓶容量的 80%左右，不得用樣品洗滌樣品瓶。樣品采集完畢后，迅速用無菌包裝紙包扎樣品瓶。

7.2 樣品保存

樣品采集后宜在 2 h 內(nèi)檢測，否則應(yīng)在 10 ℃以下冷藏保存運輸，但不得超過 6 h。實驗室接收樣品后，不能立即開展檢測的，樣品應(yīng)在 4 ℃以下冷藏保存，并在 2 h 內(nèi)檢測。

注：宜使用生物安全周轉(zhuǎn)箱進行樣品周轉(zhuǎn)。

8 分析步驟

8.1 方法程序

樣品中枯草芽孢桿菌黑色變種的檢測程序見圖 1。

8.2 樣品過濾

用無菌鑷子（6.10）以無菌操作夾取無菌濾膜（5.14）貼放在已滅菌的過濾裝置（6.8）上，固定好過濾裝置。將樣品充分混勻后取 100 ml 抽濾，以無菌水（5.16）沖洗濾器內(nèi)壁 2～3 次。

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