警告：操作時應按要求佩戴防護器具，做好無菌防護；實驗室操作需在無菌操作設備內進行，避免吸入呼吸道或接觸皮膚和衣物。

1 適用范圍

本標準規定了鑒定水中滅菌指示微生物的生物學檢測方法。

本標準適用于經滅菌處置的廢水中指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的鑒定。

2 規范性引用文件

本標準引用了下列文件或其中的條款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本適用于本標準。

GB/T 6682分析實驗室用水規格和實驗方法

HJ 494 水質 采樣技術指導

HJ/T 91 地表水和污水監測技術規范

3 術語和定義

下列術語和定義適用于本標準。

3.1

枯草芽孢桿菌黑色變種 Bacillus subtilis var. niger

在含酪氨酸的培養基上形成黑色色素的革蘭氏陽性芽孢桿菌，其營養細胞呈桿狀，單個或呈短鏈狀排列，芽孢橢圓形，中生，不膨大，能利用甘油、甘露糖，還原硝酸鹽，水解淀粉，不能利用苦杏仁苷、甘露醇。

4 方法原理

滅菌處置后的廢水通過孔徑為 0.45 μm 的濾膜過濾，細菌和芽孢被截留在濾膜上，然后將濾膜置于酪氨酸選擇性培養基上，37℃培養 72 h～96 h，枯草芽孢桿菌黑色變種產生的酪氨酸酶可分解利用酪氨酸形成黑色素，產生黑色的特征菌落。對特征菌落進行染色鏡檢和生化試驗做進一步鑒定，枯草芽孢桿菌黑色變種為革蘭氏陽性芽孢桿菌，營養細胞呈桿狀，單個或呈短鏈狀排列，芽孢橢圓形，中生，不膨大，能利用甘油、甘露糖，還原硝酸鹽，水解淀粉，不能利用苦杏仁苷、甘露醇。根據結果報告檢出或未檢出枯草芽孢桿菌黑色變種。

5 干擾和消除

5.1 活性氯具有氧化性，能破壞微生物細胞內的酶活性，導致細胞死亡，可在樣品采集（8.1） 時加入硫代硫酸鈉溶液（6.13）消除干擾。

5.2 重金屬離子具有細胞毒性，能破壞微生物細胞內的酶活性，導致細胞死亡，可在樣品采集（8.1）時加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.14）消除干擾。

6 試劑和材料

除非另有說明，分析時均使用符合國家標準的分析純試劑，實驗用水應滿足 GB/T 6682中三級水的要求。

6.1 酪氨酸瓊脂培養基。

6.2 營養瓊脂培養基。

6.3 淀粉培養基。

6.4 硝酸鹽培養基。

6.5 甘油復紅肉湯培養基。

6.6 甘露糖生化培養基。

6.7 甘露醇生化培養基。

6.8 苦杏仁苷生化培養基。

6.9 革蘭氏染色液。

6.10 芽孢染色液。

注：6.1～6.10 的成分及制法詳見附錄 A，其中 6.2～6.10 也可使用市售商品化培養基或試劑。

6.11 硫代硫酸鈉（Na2S2O3·5H2O）。

6.12 乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2O8Na2·2H2O）。

6.13 硫代硫酸鈉溶液：ρ=0.10g/ml。

稱取 15.7g 硫代硫酸鈉（6.11），溶于適量水中，定容至 100 ml，臨用現配。

6.14 乙二胺四乙酸二鈉溶液：ρ=0.15 g/ml。

稱取 15 g 乙二胺四乙酸二鈉（6.12），溶于適量水中，定容至 100 ml，此溶液保質期為 30 d。

6.15無菌濾膜：直徑 50mm，孔徑 0.45 μm 的醋酸纖維濾膜。

按無菌操作要求包扎，經 121℃高壓蒸汽滅菌 20min，晾干備用；或將濾膜放入燒杯中，加入實驗用水，煮沸滅菌 3 次，15 min/次，前 2 次煮沸后需更換水洗滌 2～3 次。

6.16 石蠟質封口膜。

6.17 無菌水：取適量實驗用水，經 121℃高壓蒸汽滅菌 20 min，備用。

7 儀器和設備

7.1 采樣瓶：具螺旋帽或磨口塞的 500 ml 廣口玻璃瓶。

7.2 恒溫培養箱：允許溫度偏差 36℃±1℃。

7.3 高壓蒸汽滅菌器：121℃可調。

7.4 pH 計：準確到 0.1pH 單位，或更高精度。也可使用 pH 比色管或pH 精密試紙。

7.5 顯微鏡：物鏡 10×倍、20×倍、40×倍，油鏡 100×倍，目鏡 10×倍或 15×倍。

7.6 分析天平：感量 0.0001 g。

7.7 培養皿：直徑 90 mm。

7.8 過濾裝置：配有砂芯濾器和真空泵，抽濾壓力勿超過-50kPa。

7.9 接種環。

7.10 鑷子。

7.11 移液管：1 ml±0.01 ml、10 ml±0.1 ml。也可使用計量合格的可調式移液器。

7.12 量筒：100 ml。

7.13 三角瓶：100 ml。

7.14 酒精燈。

7.15 無菌操作設備：無菌室或超凈工作臺、生物安全柜。

注：移液管、采樣瓶、培養皿、三角瓶等玻璃器皿試驗前要按無菌操作要求包扎，高壓蒸汽滅菌器（7.3）121℃滅菌 20 min，烘干，備用。

8 樣品

8.1 樣品采集

點位布設及采樣頻次按照 HJ/T 494 和HJ/T 91 的相關規定執行。

采集微生物樣品時，采樣瓶（7.1）不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。

如果采集的是含有活性氯的樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液（6.13），以除去活性氯對細菌的抑制作用（每 125 ml 容積加入 0.1 ml 的硫代硫酸鈉溶液）；如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.14），以消除干擾（每 125 ml 容積加入 0.3 ml 的乙二胺四乙酸二鈉溶液）。

注：15.7 mg 硫代硫酸鈉（6.11）可去除樣品中 1.5 mg 活性氯，硫代硫酸鈉用量可根據樣品實際活性氯量調整。

8.2 樣品保存

采樣后應在 2 h 內檢測，否則，應 10℃以下冷藏但不得超過 6 h。實驗室接樣后，不能立即開展檢測的，將樣品于 4℃以下冷藏并在 2 h 內檢測。

9 分析步驟

9.1 方法程序

樣品中枯草芽孢桿菌黑色變種的鑒定程序見下圖 1。

注：“＋”表示反應結果陽性，“－”表示反應結果陰性。

圖 1 枯草芽孢桿菌黑色變種檢測流程

9.2樣品過濾

用滅菌鑷子（7.10）以無菌操作夾取無菌濾膜（6.15）貼放在已滅菌的過濾裝置（7.8） 上，固定好過濾裝置。將樣品充分混勻后取 100 ml（高濃度樣品可減少過濾樣品量或將樣品稀釋）抽濾，以無菌水（6.17）沖洗器壁 2～3 次。樣品過濾完成后，再抽氣約 5 s，關上開關。