檢測及試驗方法

　　實驗試劑

　　甲醇、乙腈，均為色譜純，德國CNW技術有限公司；乙酸銨、乙酸，色譜純，ACS美國恩科公司生產；水為實驗用三級水。

　　多菌靈標準品、甲基托布津標準品、百菌清標準品，德國Dr.Ehrenstorfer公司。

　　弗洛里硅土SPE柱、C18SPE柱、中性氧化鋁SPE柱，均為500 mg/6mL，德國Simon Aldrich公司生產。

　　色譜條件

　　色譜柱，Agilent Eclipse Plus C18(4.6×250 mm，5μm)，美國安捷倫科技有限公司。流動相：A為10 mmol·L-1乙酸銨水溶液(用乙酸調節pH至4.5)，B為甲醇；檢測波長：240 nm，270 nm；柱溫：40℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10μL。梯度洗脫程序如表1所示。

　　標準溶液的配制

　　精密稱取多菌靈、甲基托布津和百菌清標準品適量，用甲醇配制成濃度為1mg.mL-1的標準貯備液。取適量的標準貯備液用甲醇配制成不同濃度的混合標準液。

　　樣品的處理

　　取代表性樣品約10 g，將其剪碎至2 mm×2 mm以下，混勻。準確稱取1 g(精確至0.001 g)試樣，置于50 mL有蓋離心管中，加入20 mL乙腈，超聲提取30 min，提取液過濾于圓底燒瓶中，殘渣再用10 mL乙腈重復提取一次，過濾。提取液合并后，于旋轉蒸發儀中，40℃水浴旋轉蒸發至約5 mL，轉入預先用乙酸乙酯活化的弗羅里硅土SPE小柱中。再用5 mL乙腈溶液洗滌圓底燒瓶，合并洗滌液加入硅土柱中，然后用5 mL乙腈-乙酸乙酯(1∶1)淋洗小柱兩次，收集流出液經40℃水浴旋轉蒸發至近干，用甲醇溶解并定容至1 mL，經0.45μm的有機系微孔濾膜過濾，供液相色譜檢測。

　　樣品凈化條件的選擇

　　皮革樣品基質復雜，干擾成分較多，提取溶液需要經過有效凈化，避免干擾測定。本實驗采用固相萃取技術對樣品提取液進行凈化，分別考察了中性氧化鋁柱、弗洛里硅土柱、C18柱這三種SPE小柱的凈化效果，其中弗洛里硅土柱效果*佳；乙腈-乙酸乙酯混合洗脫劑對三種目標物在弗洛里硅土小柱上的洗脫能力優于乙腈、乙酸乙酯、甲醇等單一溶劑，對多菌靈、甲基托布津和百菌清的回收率都達到90%以上。

　　樣品提取條件的選擇

　　甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷等溶劑均能提取多菌靈、甲基托布津和百菌清。經實驗比較，乙腈同時提取皮革樣品中的多菌靈、甲基托布津和百菌清效果*好。所以本實驗采用乙腈作為提取溶劑。

　　色譜條件的優化

　　紫外檢測波長的選擇

　　用多菌靈、甲基托布津和百菌清的標準溶液進行紫外光譜掃描，掃描范圍200~800 nm。多菌靈在235 nm和275 nm都有較強的紫外吸收，甲基托布津在229 nm和267 nm有較強的紫外吸收，百菌清在240 nm處有很強的紫外吸收。為保證三種待測物均有較好的響應值，選取240 nm作為百菌清的檢測波長，選取270 nm作為多菌靈和甲基托布津的檢測波長。DAD光譜圖見圖1、圖2和圖3。

    色譜柱與流動相的選擇

　　C18液相色譜柱對多菌靈、甲基托布津和百菌清均有較好的保留，可用作液相色譜分析柱。本文選用Agilent Eclipse Plus C18(4.6×250 mm，5μm)色譜柱進行分析。考察了甲醇-水(體積比20∶80)等度洗脫，多菌靈和甲基托布津保留值低，出峰快，均在3分鐘之內出峰，兩種物質分離不好，易受雜質干擾。實驗比較了甲醇-水和甲醇-乙酸銨水溶液兩種流動相體系對多菌靈、甲基托布津和百菌清保留時間的影響，發現在甲醇-乙酸銨水溶液流動相中，多菌靈的保留時間由水-甲醇流動相的2.6 min變為3.5 min；甲基托布津由2.9 min變為14.5 min；百菌清由4.7 min變為22.3 min。因此本文選用“1.2”的甲醇-乙酸銨水溶液梯度洗脫程序作為流動相體系，能夠更好地將3種目標物質有效地分離，提高色譜柱對目標物質的保留，避免雜質峰的干擾，適合皮革類復雜基質樣品的檢測。多菌靈、百菌清和甲基托布津標準溶液的液相色譜圖見圖4和圖5。

　　線性范圍、檢出限與定量下限

　　準確配制濃度為0.5 mg·L-1、1 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1、15 mg·L-1的多菌靈、甲基托布津和百菌清的混合標準溶液，每個濃度的混合標準液重復測定5次，以平均色譜峰面積為縱坐標，標樣質量濃度(mg·L-1)為橫坐標繪制標準工作曲線，計算相關系數。多菌靈、甲基托布津和百菌清的線性關系見表2，多菌靈、百菌清和甲基托布津定量下限LOQ(S/N=10)分別為0.06 mg·L-1、0.8 mg·L-1、0.5 mg·L-1。多菌靈、百菌清和甲基托布津的檢測限LOD(S/N=3)分別為0.02 mg·L-1、0.24 mg·L-1、0.15 mg·L-1。

　　回收率與精密度

　　在空白的皮革樣品中添加多菌靈、百菌清和甲基托布津標樣，使樣品中多菌靈、百菌清和甲基托布津的添加水平分別為1.0、5.0和10.0 mg/kg，每個加標水平做6個回收實驗，平均回收率和變異系數(CV)見表3。空白皮革樣品中加標色譜圖見圖6和圖7。