檢測及試驗(yàn)方法

　　樣品前處理(下述提取步驟，均須避光進(jìn)行。)

　　1.果汁飲料稱取2g試樣于10mL容量瓶中,加入40μL 50μg /mL內(nèi)標(biāo)液(甲氨蝶呤)和100μL1mg/mL BHT溶液，用水定容至刻度后過膜待測。

　　2.大米、果凍、餅干稱取2g試樣于10mL容量瓶中，加入40μL50μg/mL內(nèi)標(biāo)液和100μL 1mg/mL BHT溶液，用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并定容至刻度，渦旋混勻1min，超聲15min，4000 r /min離心10 min，過膜待測。

　　3.含乳飲料稱取2g試樣于10mL容量瓶中，加入40μL50μg/mL內(nèi)標(biāo)液和100μL 1mg/mL BHT溶液，用4%三氯乙酸溶液溶解并定容至刻度，渦旋混勻1min，超聲15min，4000 r/min離心10min，過膜待測。

　　4.奶粉稱取5g試樣于離心管中，加入200μL50μg/mL內(nèi)標(biāo)液和500μL1 mg/mL BHT溶液，用25mL45～50℃水溶解并渦旋混勻1 min，超聲15 min。待溶液溫度降至室溫后，用5 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)至pH 1.90±0.5，放置2min，再用5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 4.7±0.5。將溶液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用水定容至50mL，超聲10min，4000r/min離心10min，過膜待測。

　　儀器條件

　　1.色譜條件

　　Waters HSS T3色譜柱( 50 mm×2. 1 mm，1.7μm) ;進(jìn)樣量5μL;柱溫30℃;流動相:A為10 mmol /L乙酸銨( pH 6. 3)水溶液，B為甲醇;梯度洗脫程序: 0～1 min保持B為1%;1～4min，B從1%升至55%; 4～6 min保持B為55%; 6～6.1 min，B降至1%; 6.1～10 min保持B為1%。

　　2.質(zhì)譜條件

　　大氣壓電噴霧離子源，正離子電離模式。毛細(xì)管電壓3.5kV;噴霧壓力45psi;氣簾氣流量5L/min;鞘氣流量10L/min;鞘氣溫度350℃;毛細(xì)管溫度350℃;定性離子對: m/z442.4→176.9，碰撞能量33eV;定量離子對m/z 442.4→295.1，碰撞能量21eV;甲氨蝶呤m/z 445.0→308.0，碰撞能量20eV。

　　結(jié)果與討論

　　1.基質(zhì)及內(nèi)標(biāo)物的選擇

　　依據(jù)GB14880-2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，按照可強(qiáng)化食品的不同類別選擇并確立6種代表性食品:果汁、奶粉、含乳飲料、大米、餅干和果凍。

　　通過大量查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，選取D4-煙酸、D4-煙酰胺、乙酰苯胺、馬尿酸、甲氨蝶呤及33C5-葉酸放射性同位素內(nèi)標(biāo)等6種內(nèi)標(biāo)，對其安全性及定量結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行比較，*終選擇甲氨蝶呤作為內(nèi)標(biāo)物。

　　2.葉酸的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

　　葉酸在酸性溶液中熱不穩(wěn)定，在堿性溶液中易被氧化，水溶液遇光迅速分解，因此需要通過控制溶液所處的環(huán)境改善葉酸儲備液的穩(wěn)定性。分別用水、1%氨水、5mgVc、0.01 mol/LHCl(pH 2.0)、0.01mol/L HCl(pH 5.0)、25μLβ-巰基乙醇、1%BHT、10 mmol /L乙酸銨和3%偏磷酸等不同溶劑配制濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并將配制好的溶液用鋁箔做避光保護(hù)，4℃冰箱中儲存。測試不同溶劑不同時(shí)間段的峰面積并進(jìn)行比較，得到葉酸的穩(wěn)定性曲線圖

葉酸的穩(wěn)定性曲線圖

　　由圖可知，葉酸在強(qiáng)酸條件下容易分解，當(dāng)采用0.01 mol/L HCl(pH 2.0)和3%偏磷酸作為溶劑時(shí)，葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分解現(xiàn)象十分明顯;采用水、0.01 mol/LHCl(pH =5.0)和10mmol /L乙酸銨作為溶劑時(shí)，溶液在16h內(nèi)穩(wěn)定性較好，基本無分解，16～48h出現(xiàn)緩慢分解，48h后分解現(xiàn)象十分明顯;當(dāng)采用1%氨水溶解葉酸時(shí)，1～4d內(nèi)無分解，在第5d分解了10%，因此葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液在1～4d內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，能夠滿足定量分析實(shí)驗(yàn)要求。同時(shí)，比較了Vc、β-巰基乙醇和BHT 3種抗氧化劑的抗氧化效果，發(fā)現(xiàn)添加BHT的溶液在72 h內(nèi)基本無分解，因此樣品前處理過程中加入BHT，能夠避免葉酸的氧化，有利于穩(wěn)定性的提高。

　　二丁基羥基甲苯( BHT)的優(yōu)化

　　由于葉酸的不穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)過程中需要加入BHT避免葉酸的氧化。用0.01 mol/L HCl溶液配制濃度為100μg/mL的儲備液，常溫下放置12h后，比較了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)BHT溶液(0.1%，0.5%，0.8%，1.0%，1.2%，1.5%，2.0%)對葉酸穩(wěn)定性的影響。對新配制的葉酸儲備液進(jìn)行檢測，此時(shí)得到的峰面積數(shù)據(jù)認(rèn)為無損失，記為****;然后分別取含不同濃度BHT的葉酸溶液進(jìn)行檢測，得到各標(biāo)準(zhǔn)儲備液的峰面積，將此峰面積與新配制溶液得到的峰面積進(jìn)行比較;以BHT含量為橫坐標(biāo)，百分比為縱坐標(biāo)，得到各標(biāo)準(zhǔn)儲備液的穩(wěn)定性數(shù)值如圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著BHT用量的增多，葉酸的分解速度變慢，穩(wěn)定性提高，但當(dāng)達(dá)到1%時(shí)，溶液中的葉酸趨于穩(wěn)定，因此實(shí)驗(yàn)選取加入1%的BHT作為抗氧化劑。

BHT 使用量對反應(yīng)的影響