微生物常規鑒定技術
(一)形態結構和培養特性觀察
1、微生物的形態結構觀察主要是通過染色,在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細胞結構(包括細胞壁、細胞膜、細胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性進行觀察,直觀地了解細菌在形態結構上特性,根據不同微生物在形態結構上的不同達到區別、鑒定微生物的目的。
2、細菌細胞在固體培養基表面形成的細胞群體叫菌落(colony)。不同微生物在某種培養基中生長繁殖,所形成的菌落特征有很大差異,而同一種的細菌在一定條件下,培養特征卻有一定穩定性。以此可以對不同微生物加以區別鑒定。因此,微生物培養特性的觀察也是微生物檢驗鑒別中的一項重要內容。
(二)生理生化試驗
微生物生化反應:指用化學反應來測定微生物的代謝產物,生化反應常用來鑒別一些在形態和其它方面不易區別的微生物。因此微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據之一。
微生物檢驗中常用的生化反應有:
1、糖酵解試驗
不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異,或能利用或不能利用,能利用者,或產氣或不產氣。可用指示劑及發酵管檢驗。
2、淀粉水解試驗
某些細菌可以產生分解淀粉的酶,把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后,遇碘不再變藍色。
3、v-p試驗
某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養基中能分解葡萄糖產生丙酮酸,丙酮酸縮合,脫羧成乙酰甲基甲醇,后者在強堿環境下,被空氣中氧氧化為二乙酰,二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物,稱v-p(+)反應。
4、甲基紅(methyl red)試驗
腸桿菌科各菌屬都能發酵葡萄糖,在分解葡萄糖過程中產生丙酮酸,進一步分解中,由于糖代謝的途徑不同,可產生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產物,可使培養基ph值下降至ph4.5以下,使甲基紅指示劑變紅。
5、靛基質(imdole)試驗
某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合,形成玫瑰吲哚,為紅色化合物。
6、硝酸鹽(nitrate)還原試驗
有些細菌具有還原硝酸鹽的能力,可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。
7、明膠(gelatin)液化試驗
有些細菌具有明膠酶(亦稱類蛋白水解酶),能將明膠先水解為多肽,又進一步水解為氨基酸,失去凝膠性質而液化。
8、尿素酶(urease)試驗
有些細菌能產生尿素酶,將尿素分解、產生2個分子的氨,使培養基變為堿性,酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導酶,因為不論底物尿素是否存在,細菌均能合成此酶。其活性*適ph為7.0。
9、氧化酶(oxidase)試驗
氧化酶亦即細胞色素氧化酶,為細胞色素呼吸酶系統的終末呼吸酶,氧化酶先使細胞色素c氧化,然后此氧化型細胞色素c再使對苯二胺氧化,產生顏色反應。
10、硫化氫(H2S)試驗
有些細菌可分解培養基中含硫氨基酸或含硫化合物,而產生硫化氫氣體,硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。
11、三糖鐵(TSI)瓊脂試驗
本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發酵產酸或產酸產氣(變黃);產生硫化氫(變黑)。葡萄糖被分解產酸可使斜面先變黃,但因量少,生成的少量酸,因接觸空氣而氧化,加之細菌利用培養基中含氮物質,生成堿性產物,故使斜面后來又變紅,底部由于是在厭氧狀態下,酸類不被氧化,所以仍保持黃色。
12、硫化氫-靛基質-動力(sim)瓊脂試驗
以接種針挑取菌落或純養物穿刺接種約1/2深度,置361℃培養18~24h,觀察結果。培養物呈現黑色為硫化氫陽性,混濁或沿穿刺線向外生長為有動力,然后加Kovacs氏試劑數滴于培養表面,靜置10min,若試劑呈紅色為靛基質陽性。培養基未接種的下部,可作為對照。本試驗用于腸桿菌科細菌初步生化篩選,與三糖鐵瓊脂等聯合使用可顯著提高篩選功效。