作者：菩提

編輯：測老哥

　　本人喜好微生物、生物學的程度和喜歡溫柔美麗善良姑娘的程度不向上下。對微生物學的熱情使得我在從事微生物基礎檢測的理論方面可能有所心得。

　　說明一下，我講的方法是方法，也不是方法。如果有一個人智慧得到開啟，就沒白寫吧。

　　這篇文章針對的人員主要是從事微生物學檢驗檢測，需要接觸到細菌、真菌培養、分離鑒定、劃線分離以及計數報結果的的人員。

　　都說微生物檢驗，那么啥是微生物呢？把“微生物”三個字拆開來就明白了。

　　微生物的定義：肉眼看不見的微小的生物。

　　微生物包括：細菌、真菌、原生動物、藻類、病毒，朊病毒、立克次氏斯體等。我們檢測主要接觸到的是細菌、真菌里面的霉菌和酵母、病毒，水環境里面的還檢測幾個原生動物-寄生蟲的卵。

　　延伸一下：以前還把放線菌單獨提出來，分類老師提到時候會說“..細菌、真菌、放線菌?”，現在放線菌包含在細菌里。細菌呢又分古細菌，真細菌，我們現在檢測的基本是真細菌。真菌里面主要研究的是霉菌和酵母，對于其他大如蘑菇什么的研究的少。

　　微生物里面只有細菌和真菌形成菌落，其他的不能形成菌落。所以微生物學里面用到培養基這種形成菌落的間接檢測方法只能檢測細菌、霉菌和酵母。

　　我今天講的就是這部分。

　　這里的標準方法非常狹義，只指檢測細菌、霉菌和酵母等的方法。因為這部分用到的是微生物學里面*基礎的知識。

　　這一部分標準加一起，也能摞很厚，國內的、國外的、進出口的、環境的、食品的、化妝品的。但從學過微生物學這么課程的人而言，其根本方法只有4-6個。需要掌握的方面不足10個，了解了就一通百通了。

　　為什么會這樣呢？這就要理順一下微生物學和檢測方法的關系：先發現了細菌，后有了微生物學這門科學，然后應用到各行各業（當然應用是說檢測，要說利用微生物的話，我們老祖宗在沒微生物學的古時候早就會利用了），一方面可以保證食品安全，也可以了解產品里面衛生狀況等。作為檢測質量的一個手段。

　　新人突然接觸標準，可能會手足無措，只能一個標準一個標準的去測。不懂原理也不敢改動，結果出來也不會處理和分析。沒有太多的微生物的知識，所以更談不上融匯了。所以我丟出一塊磚，教大家怎么去學微生物以及怎么去對待標準。學習了根本方法，就不會被標準牽著，學個百人敵吧。

　　1、微生物檢測，分定量和定性。

　　定性從本質上看，是一種定量。仔細對照標準，定量方法里面抽出一根來，從流程上看就是定性了。所以定量定性就被你學到一起去了。

　　那么從學科上呢，要掌握的知識有：微生物學，分子生物學，免疫學。

　　我只說微生物的。其他二類留給后來人。

　　2、微生物檢測項目，概況起來就2類：

　　　　一、衛生指標（細菌總數、真菌總數、總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌等）。

　　　　二、各種食源性的致病菌（沙門、志賀，副溶血，耶爾森氏菌，金黃葡，產氣莢膜梭菌，單增、乳酸菌等等。

　　衛生指標是啥意思？指示菌。就像紅綠燈。比如菌落總數，數大，說明產品衛生狀況不好，含了太多菌。沒有菌，說明產品質量不錯，能放很久。

　　從邏輯上講：

　　——菌落總數里面測出來沒菌，那么99%的概率沒有致病菌了（有人要問剛才說菌落總數里面提到了99%沒有致病菌，還有1%呢？因為是間接方法有可能測不出來啊。達到方法*限了。微生物學方法不能保證****抓到細菌的。）。

　　——菌落總數多呢？對不起，有可能里面有致病菌！也可能沒有。沒有能松口氣了嗎？不能，因為沒有致病菌只說明食品是相對安全的，吃了不中毒。但會腐敗變質啊，質量就完了。這就是菌落總數的指示作用。針對的不是某一個菌，而是一個范圍。

　　——同理總大腸、耐熱大腸菌群，大腸埃希氏菌也是這個道理。只不過是研究的受腸道菌污染的可能性以及受近期污染還是污染的比較久遠了。

致病菌就簡單多了，致病菌的方法就是針對某種或某屬下菌的特點然后針對性的開發出來的方法。

　　微生物學檢測過程主要包括：取樣、樣品處理及稀釋、把樣品加到培養基里，培養，計數報結果或后續驗證然后計數報結果，定量報數，定性報有是沒有（專業詞匯叫檢出/未檢出）。

　　1、取樣

　　取樣很復雜，產品有多么五花八門，取樣就多么紛繁復雜。要研究產品特性的，這里講不完。總結一下重要就是：

　　取樣要有代表性。取樣不能污染。取樣很重要。

　　不然后面測得再好，結果不能反應實際產品里真實情況，也白搭。

　　這個責任很重，重到什么程度？第三方檢測會寫上“只對來樣負責”，意思就是廠家你取樣你負責，我不清楚你咋取的，我無法負責。挺合理吧？呵呵。

　　2、樣品處理及稀釋

　　取樣和樣品處理分不開，所以這里的樣品處理主要說的是把樣品打散，比如食品25g樣品加入225mL然后均質器拍打1分鐘~2分鐘弄勻了等。樣品處理也是個大工程。具體問題具體分析把。稀釋主要采用十倍梯度稀釋法稀釋樣品。

　　3、把樣品加到培養基里面，做成管子或平板

　　這里會講3個方法。固體培養基里有2個方法：混菌傾注平板法，稀釋涂布法，液體培養方法有：MPN法或叫多管發酵法

　　4、放培養箱里培養

　　培養就相當于飼養，實驗員其實就是飼養員。只不過別人養貓養狗你養細菌等。細菌放細菌培養箱里，真菌放真菌培養箱里。看似廢話，實則有大道。下面講一下大道。

　　話說細菌和真菌分道揚鑣，成立了2個界。界是啥呢？界、門、綱、目、科、屬、種，是分類學上用來劃分范圍和從屬關系歸屬關系的分類單位。親疏遠近都在分類樹上。是生物分類的基本單位。“種”估計大家都明白吧，人有人種，狗有狗種，再往上就到屬了，然后科啊等。界呢就是*大的一個分類單位，也就是一個范圍。細菌一個大圈圈，叫細菌界，真菌一個大圈圈，叫真菌界。這界和動物界、植物界并列的。可見范圍很廣吧。

　　細菌菌落長的滑溜溜（也有不滑的，不能咬文嚼字啊），霉菌長得毛乎乎，酵母和細菌滑溜溜一樣，但酵母在顯微鏡下很有特點，橢圓的，比細菌大，是細菌的10-100倍吧，所以顯微鏡下一眼就看出來是不是酵母了。細菌呢不產孢子（雖然產芽孢），真菌產孢子，孢子是繁殖體。就是孢子是真菌的兒子，孢子很輕，可以隨風輕舞飛揚，而且真菌多子多福，有多多？有興趣的可以看一下有篇文章叫“孢子的奇妙之旅”就知道了。

　　真菌孢子亂飛，遇到適宜的溫濕度就開始長真菌，這就比較恐怖了，環境污染啊。一旦繁殖了多了，房間里面到處都是不好消毒殺死，反正就是處理起來很麻煩。為了減少麻煩和交叉污染，就要把細菌的房間和真菌的房間隔離，培養箱也不能用同一個。這一點學過微生物的很清楚其中的厲害關系，對于沒基礎的可能無知者無畏吧，在此告誡大家一定要分開哦。

　　5、培養完了，拿去數數或驗證。

　　驗證的方法原理除了前面幾個方法，還用到另外一個方法：平板劃線分離。下面就重點介紹這幾個方法。

　　1、樣品稀釋的基本方法：十倍梯度稀釋法

　　微生物數量是用個，十，百、千、萬、?,億來計算的，所以我們要選擇方便、較少稀釋數量、能滿足要求的管數做實驗。10倍一檔，好算好取，適合不愛動腦的人。試想一下，單位體積里一萬個菌你要稀釋到100個菌，用2倍，3倍，4倍，5倍呢，光算水、樣品的毫升數就搞蒙。10倍的呢，2根管子就完事。你也許說你數學不錯，計算沒問題。那我告訴你另外一個原因，細菌測不準。

　　微生物檢測方法是個間接方法。由于細菌和細菌之間，和培養基之間有各種關系，還受環境影響，所以你測的結果除了實驗室的原因外，也還是不能非常準確的反應樣品里的真實數量。所以測不太準。

　　2、微生物檢測方法之：混菌傾注平板法

　　有時也叫傾倒法，混菌法等，不管叫什么吧，你只要知道是按照下面過程進行的就行：把1mL樣品加入平皿，再傾注15-20mL的培養基，混勻，靜置冷卻，平板凝固。

　　剛才說了細菌測不準，現在頭腦風暴一下，細菌—細菌—培養基之間的關系。

　　細菌是活的，都要吃飯，培養基就是飯，一個菌在培養基里吃飯，吃完生兒子，一個變2個，按照2*2*2,?這樣下去，2的指數次方增殖。固體培養基呢？卡著細菌，跑不太遠，*后就上億的菌堆在一起。形成一坨，一億個呢，眼睛就能看見了。所以我們就叫這一坨為：一個菌落形成單位（根據英文翻譯過來的），英文縮寫用CFU表示，也當單位使。

　　——舉例，100CFU/g，就是1克樣品里的100個菌在吃飽飯后通過繁殖*后形成了100個大大小小的菌落，我們通過看到的菌落然后反推回去說樣品里面有100個菌。所以有時你會看到有些標準上面寫100個/g，那你會明白是100個菌落而不是100個菌，也就不會再用100個/g了。

　　例子舉完了，我們繼續講細菌相互之間以及細菌和培養基之間的關系。

　　——培養基上只有一個菌*后形成一個菌落，都是自己兒子們，結果反正我們能看到這一個菌，所以也就不受菌-菌影響。

　　——不只有一個菌啊，有2個，3個，10個100個呢？離得遠，相安無事，畢竟平板相對細菌，很大很大了。

　　——甄子丹說：我要打100個，培養皿說，給我倒1000個菌。壞了，這下就出問題了。空間有限，細菌之間相互打架（競爭關系，還有其他很多復雜的關系就不展開了，反正是不好的關系），制造點抑制劑啥的讓其他菌不長，再就是個子大占地方大。鋪滿整張床。所以90mm的大床只夠形成容納300個菌落。再多長不出來了。1000個菌只形成了300個CFU，是不是就不準了。所以呢，現在就明白了：

　　為什么菌落總數計數時候要求選擇30-300這個范圍。不然就不準了呀。

　　現在又要開悟了。

　　——所有的培養基上面都是規定的30-300嗎？當然不是，真菌就是10-150（GB 4789.15-2016），因為真菌菌落個子大，占床位多一點。300就不好計數了，不信你去1皿里面培養300個霉菌數數。

　　——那么大腸埃希氏菌（見GB 4789.38-2012）檢測為啥要10-100呢？因為大腸的培養基里面有選擇性抑制劑，這些規定是前人科學家通過模式統計*后發現這個范圍結果*接近樣品里面真實情況。

　　要是有喜歡繼續問的，又會問。不在30-300里面咋弄呢？這就需要分情況說明了。

　　——超過300咋辦呢？簡單啊，按照前面說的“十倍梯度稀釋”，選擇“合適稀釋度”啊。

　　所以“合適稀釋度”這個詞適合老玩家，不適合新手，對于新手應該像我上面這樣再給她啰嗦解釋一番，讓他稀釋到長出來在30-300之間的拿去計數。

　　大于300的解釋完了，再解釋一下小于30的。

　　——小于30說明樣品里菌相對較少，一共就這么多了。如果有多個稀釋度，其中稀釋過了，檢不出菌，就往高濃度測測，所以液體樣品一般要求從原液開始。固體樣品沒有原液，那就稀釋稀釋10倍咯。

　　——要是菌落數量小到全沒有。是否就萬事大吉了呢？這肯定釋放的是一個好的消息，至少說明菌很少。但也不能輕視。因為實驗是反推，就有邏輯上的思考：一個細菌能長出一個菌落，一個菌落能知道樣品里面肯定有一個菌（菌不會無中生有，是需要種傳代的，是活的生物。）；但沒有形成菌落不能說沒有菌，也有有可能沒長啊。所以釋放了2個信息：這個方法到頭了，按照這個方法可以報未檢出或小于1或小于10了。

　　——如果還想測，那就換更好的工具，比如濾膜法啊，比如MPN法。濾膜法是濃縮的方法，MPN法是靈敏度更高的方法，當然每個方法都有他們自身的缺點。

　　3、微生物檢測方法之：MPN法,也叫多管發酵法

　　多管發酵法是根據泊松分布律做出來的。這個講起來有點復雜，公式我也就不編輯了，想要弄明白泊松分布律，要學習大學的概率論和數理統計，要學概率論和數理統計就要學高等數學（微分和積分）。如果大學的忘光或壓根沒學過，也不怕，從高中學起。人大A版（或B版）數學還是很不錯的。而且有電子版，自己找找就可以學習。

　　如果忙到喝水撒尿都沒時間的話，也不想廢那個腦子，那就機械照搬吧。因為偉大的科學家們早就想到了我們搞不定，早就制好了葵花寶典。把泊松分布的公式直接一個一個算出來了，編制成了MPN表。

　　那我們就只需要照表去執行就行。干講難懂，那就舉例吧。

　　舉例：100CFU/mL的樣品原液，我們拿來做MPN，怎么弄呢？

　　先按十倍梯度稀釋把樣品勻液弄好。稀釋3個稀釋度，加上原液就有了：10的0,12,3次方,計四個稀釋度，然后我們按照9管法（還有其他數量的管法，原理相通），加樣，如圖：

　　原液1mL進10mL的管子，3支，其他相同。分別加好后，我們就等于把菌分下去了。10的0次管子里是100個菌，培養后。看到菌了。管子就記錄為1，看不到菌就記錄為0，所以分下去的 菌個數是（100，100,100）：（10,10,10）：（1,1,1）（1,0,0）*后的100是把0.1個菌進一法認為至少有一個菌的情況來估算的，也可以估算為沒有。那么我們對應的MPN結果呢，就是3:3:3:1

從這里不難看出，如果你的菌太大，比如1000個，那么你前面三個管子就沒啥意義，因為都能接到菌。這也就是為什么MPN為啥對100CFU/mL“濃度”以下的菌才更好使的緣故。

　　方法是這么做，但MPN還有它的難點。很有必要解釋一下。

　　我這個圖是理想狀態，也就是100個菌都非常均勻了，那么實際情況不會這么勻，就會出現3332,3330,3320等情況，也都是合理的，所以呢MPN的結果雖然是個概率但是一個比較寬的概率范圍，就是很不準！

　　也就提到了MPN名字的意思，MPN翻譯過來叫*大可能數（也能叫或然系數），這是一個概率事件，概率也就是說不準，“*大”只有一個，其他不*大的還有許多，后來MPN表后面就附帶了95%的置信區間。也就是說你落在95%里面的數據從概率上來講都是合理的，但實際情況是不是這樣，不一定呢。

　　而我們平板計數法獲得的結果呢？是一個確定的數據，也是事件，你做出來多少，是一個實數，就相當于已經鐵板釘釘了。那MPN得到的結果呢？是不確定的，是個可能。

　　那么有時候有人問我，我100CFU/mL和100MPN/mL結果能互通嗎？有關系嗎？互通是不可能。有關系嗎？有，但非常復雜，常人不是數學家，考慮不過來那么多因素，所以還是假裝沒有關系吧。既然是假裝，那就不互通，也認為沒有關系。有**有能力或別人有能力再去解決這個問題。

　　那么又有人問我了，那么1MPN/mL和1MPN/100mL有關系嗎？有，100倍關系。

　　但這里有一個問題，MPN表不是按照100倍關系互通。因為1MPN/100mL的表是過去弄的，歷史原因，表里面數字都被修成了整數（不能用現在人的觀點去嘲笑原來制定方法的科學家們，因為歷史是螺旋往前的，要去了解來龍去脈和理解我們的前輩的科學家們）。而新表是按照泊松率嚴格算出來的數據，有小數。所以表不能互用。等歷史問題得到了清算，有**會是一樣的。

　　4分離純化的方法之：平板劃線分離。

　　寫的有點累了，直接貼我原來教別人的吧。

　　【用灼燒后接種環取一點菌苔或細菌懸液，在平板一側邊緣處，反復涂抹在直徑約為1cm大小的面積上;灼燒接種環，冷卻后，從上述涂菌處劃出7、8條直線，前3、4條線從涂菌處劃出，后3、4條可不通過涂菌處，劃線時接種環與平板表面成30°、40°角（指手拿的環和皿平面），輕輕接觸，不要使接種環劃破表面;如上述燒灼、劃線操作再重復數次，以劃滿整個平板為宜;倒置平板，于*適溫度培養1、2天，出現單菌落即為純化后的單一細菌。】

?　　

　　我們講完了怎么做一套實驗，也講了幾個重點的方法。那我們遇到新的檢測微生物的標準的時候怎么辦呢？這就需要把新知識融入舊方法里面。

　　1、我們可以近似認為：所有的平板計數法都和菌落總數一樣。

　　各種檢測致病菌的定量方法可以看成：【菌落總數】乘以【系數】。比如總大腸菌群，VRBA上面數出來的菌，那可以看出菌落總數，然后用BGLB去獲得系數。

　　2、要了解，很多標準里面確證到*后都是求一個比例系數。

　　我們在一個平板上長出來菌，有好幾種。為了驗證這些菌是或不是，那就開始一系列生化方法了。試劑是錢啊，另外人力也不能全部都驗證了。比如有100個菌。那我們就驗證一部分。用來代替總體水平。這就是一個確地比例的方法，所以想要獲得等比例放大、縮小，就需要注意：不同類型的都要挑取部分驗證。平板法獲取的是比例，所以要挑夠個數，MPN是一根管子一個管子去驗證，你一根管子如果劃線分離出好幾個菌，只要驗證1個是，那么前面的MPN的管子里就算檢出了。定性和MPN驗的方式相似，有一個就檢出了！

　　明白了這個道理在選擇怎么獲得結果時候就可以考慮人力、時間、和試劑貴賤的經濟問題。

　　講一下GB 4789.3-2016總大腸菌群讓人模糊或容易出錯的驗證系數的地方。

　　平板用VRBA計數后，把菌分成典型和不典型，然后驗證，如果只是一個平板，大家一般不會困擾：分別計數典型、不典型菌數，等到典型/非典型比例，10根管子按比例分配去挑菌驗收。然后各算各的。

　　現在大腸菌群有2個平板（平行），有人就模糊了，有人直接把菌一平均，然后把10根管子按照1皿5管分下去了，這不科學。

　　*好的辦法是，把2個平板看成一個整體，把各自的典型和不典型分計算出來然后算出比例再乘以10個根子，把10根管子分給典型和不典型，才合理。或者有**改了，告訴你典型用5根，不典型用5根，也別規定總數了。那樣估計也好。

　　用少量菌來獲取比例系數的方法在其他好幾個實驗里面也用到，比如銅綠，比如腸桿菌科，比如金黃葡，許多標準都用到，標準不會說，你要會看。

　　比例系數的優點節約了成本，缺點有可能漏檢。所以高風險的實驗盡量多挑菌來驗證，比如沙門、單增李斯特氏菌（只是舉2個例子，其他類推）至少挑多一些菌來驗證（檢出就不需要，同時也對劃線分離提出了高要求，平時要多練習），檢不出時候要承擔更大風險所以要多驗等。

　　3、所有菌落總數原理的定量計數結果單位都是濃度單位

　　計算過程按照濃度方式進行。很多人遇到菌落總數或其他計數標準里這個公式就蒙。

　　這個公式呢，寫的復雜，并不難。你認為菌落總數是個濃度單位就好了。比如單位是CFU/mL，就是問你：1毫升樣品原液里面有多少菌啊？那解決辦法就是拆了推啊，舉4個平板為例吧。

　　2個稀釋度下有4個平板，10-1里面菌落總數226,228，10-2里面36,38，那么我們知道隱藏條件：每個皿都加了1mL樣品。10-2里面的1mL呢可以則算到10-1里面的0.1mL,所以按照分母的話，就是2.2mL，總菌落呢？就全部一加（226+228+36+38），然后總菌落數乘以總體積，不就得到1mL里面多少菌了嗎？因為算的是10-1里面的1mL的菌數，那么再把稀釋度算上推回去就好了。

　　開始頭腦風暴了。

　　——如果三個平板在范圍內呢比如38變成了21呢？21不在規定的計數范圍內，剔除。只留下3個皿計算就好了，分子還是總菌數（226+228+36）分母就變成了2.1mL咯。

　　——如果總菌落數不是真的總數呢，那就分別乘以比例系數后再去當分子啊。比如銅綠，只不過銅綠是過濾250mL水樣，*后的單位是/250mL。所以分母就不需要變了。

　　4、計數方法里面看到倒平板就是傾注平板法、或者稀釋涂布法。用到MPN管就是MPN法原理。

　　不管叫多管發酵法還是MPN法也不管是5管、12管、15管、20管等等都是同一個方法。抓住MPN表和稍有不同的關鍵點就好了。

　　5、生化實驗前做的都是分離純化，獲得純菌的過程逃不過平板劃線分離。

　　不要僥幸，沒有確定的純菌后續的驗證都是錯的，錯的，錯的！而且菌種的傳代、驗收、保存都要用到。

　　微生物學是一門方法少、知識多的學科，理解力用的不多，記憶力用的多。這就是它門檻低的地方。許多知識你只需要記住你就看似會了。

　　所以為了做到“看似”，平時需要多積累知識，積累知識沒有捷徑，要用笨方法，積累各種菌或屬或科的共同點，比如腸桿菌科是革蘭氏陰性，氧化酶陰性這樣的大方向信息。

　　有本書還不錯，中國工業微生物菌種保藏管理中心出的標準菌種圖譜，說它不錯，因為它信息準確性高，不像百度那種不靠譜的知識。當然百度也是很好的。查資料時候貨比三家再信吧，就算錯了也沒關系，錯的總會在適當的時候被發現，然后加強了記憶。這就是辯證和禪吧。沒有**。把上面的標準菌株的信息獲取吸收。然后再去學一門基礎的微生物學、生物化學、細胞生物學等課程吧，如果不愿意看書，可以問我要老師講課的視頻，超級通俗易懂，都能學會。

　　微生物學門檻低，不代表他很低級。微生物學屬于大隱隱于市的學問。**你想啊，世界上微生物團體這么大，會那么輕易被看穿的嗎？所以我們一方面要積累知識，總結啊歸納啊貫通啊，把各部分連貫起來，還要了解新知識，新手段，比如分子學手段啊，比如飛行時間質譜啊，比如梅里埃那啥啥設備，然后還要會運用到實踐中去分析解決問題。

　　在檢測標準方面，需要老實的按照對應的的標準去做實驗，這是有一個框的問題，只能這么做。但在這個基礎上，國標沒通過的方法有時候也要借鑒，尤其西方新的方式方法。微生物我們暫時一段時間是超不過西方國家的，這是歷史原因和國情和我們科學發展史有關的，但我們可以追啊。追呢不只是標準制定者、專家的事情。是每個人都可以學的事情。比如我們的單核細胞增生李斯特氏菌標準到了更新到2016年版本了，2017年 ISO 11290-1-2017更新了1和2本，其中很大一部分就是按照*新李斯特氏菌屬的特點制定的方法。不學習可以嗎？當然不可以，落后就要挨打。

　　我們雖然只是一個小小的檢測員，要自信自強，雖然有時候我們的工資不高、老板也不一定重用你，但這有什么關系呢？要學禪啊，你的智慧你的能力就像你是一個細菌一樣，終將破壞、或造福這個世界的。

　　而且我們檢測人肩上的責任一點也不輕。微生物亦正亦邪，所以我們檢測人員為了人民的生活質量，為了不讓微生物的魔性禍亂人間，就要把好檢測這一關，因為檢測是事后諸葛亮，是*后一關了。

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