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病毒中和試驗主要有兩種實驗方法：固定病毒–稀釋抗血清法和固定抗血清–稀釋病毒法。

固定病毒–稀釋抗血清法
該病毒中和試驗方法主要用于血清抗體滴度的測量。將 100 CCID50/單位體積的病毒分別與連續倍比稀釋的病人急性期或恢復期血清混合孵育 1 h 后，把混合液接種于敏感宿主，然后觀察不同稀釋度的血清保護宿主感染病毒的情況。
實驗材料：
具有感染力的病毒（已滴定的標準病毒 100 TCID50 0. 1 ml 或 100 LD50 0. 1 ml）
試劑、試劑盒：
病毒抗體陽性的血清和病毒抗體陰性的血清：急性期或恢復期血清（通常 56℃ 30 min 滅活）敏感宿主體系：敏感細胞、敏感動物、雞胚
儀器、耗材：
96 孔細胞培養板
實驗步驟：以細胞培養為例
①用細胞維持液連續倍比稀釋急性期和恢復期血清；
②取1. 0 ml 不同濃度的稀釋血清分別與 1. 0 ml 標準病毒 (100 CCID50/0. 1 m) 混合，置 37℃水浴作用1 h;
③取混合液 0. 2 ml 分別加到細胞已長成單層的 96 孔細胞培養板中，每一稀釋度接種 4孔細胞。同時設 4孔正常細胞對照和設 4 孔 100 CCID50/0. 2 ml 作病毒對照；
④設病毒滴度對照。將病毒液連續 10倍稀釋后，加到細胞已長成單層的 96 孔細胞培養板中，每個稀釋度接種 4孔細胞，每孔加 0. 1 ml。必要時還要設抗體陽性血清對照和抗體陰性血清對照。
⑤將 96 孔細胞培養板置 37℃、 5% CO2 溫箱中孵育，每日觀察細胞病變效應 (CPE) 。
⑥50% 血清中和終點的計算： 50% 細胞不產生細胞病變 (CPE) 的血清稀釋度。根據細胞病變程度，用 Reed-Muench 法計算 50%血清中和終點。
注意事項：
1. 病毒懸液病毒應低溫保存，融化后只可使用一次，避免反復凍融，這樣會降低病毒的毒力。多次進行同一試驗時，應使用同一批凍存的病毒，以減小誤差。
2. 抗血清人和動物血清中含有一些非特異性的物質，這些物質可增強抗病毒抗體的中和作用，也可以滅活病毒，通常采用加熱的方法破壞這些物質。不同來源的血清滅活溫度不盡相同，人、豚鼠血清為 56℃, 兔為 65℃, 時間為 20~30 min。在細胞培養中進行中和試驗時，要注意避免使用相同的細胞。
3. 孵育的溫度和時間病毒與抗血清在 0℃時不發生反應， 5℃以上才發生中和反應。通常采用 37℃ 孵育1 h, 一般的病毒即可和抗血清充分反應。但是，一些特殊的病毒在此反應條件下不能充分反應，試驗時應根據不同的病毒改變孵育的時間和溫度。
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固定抗血清–稀釋病毒法
實驗材料：已知標準的抗病毒血清 (20抗體單位 0. 1 ml)
試劑、試劑盒：已知陰性血清 (56℃ 30 min 滅活）宿主：敏感細胞、敏感動物、雞胚
儀器、耗材：細胞培養板、水浴鍋、細胞培養箱
實驗步驟：
①用細胞維持液連續 10倍稀釋病毒分離物10-1~10-8);
②取 0. 6ml不同濃度的病毒稀釋液與 0. 6 ml 標準的抗病毒血清混合；
③再取 0.6ml 不同濃度的病毒稀釋液與 0. 6 ml 已知的陰性血清混合；
④將混合液置 37℃ 水浴1h, 然后取 0. 2 ml 混合液分別接種于細胞已長成單層的 96孔細胞培養板中，每一稀釋度接種 5孔，設 5 孔正常細胞對照；
⑤將細胞培養板置 37℃ 、 5% CO2 溫箱中孵育，每日觀察細胞病變效應 (CPE) 。
⑥中和試驗的病毒 CCID50 的計算：細胞培養中，通常是以病毒的組織半數感染量 (CCID50/單位體積）作為中和反應的終點。而動物試驗中，用動物半數致死量 (LD50/單位體積）作為中和反應的終點。中和試驗中，抗血清組的 CCID50 與陰性血清組的 CCID50 之差的對數等于或大于2, 才能說明中和試驗結果為陽性。
注意事項：
用中和試驗方法鑒定病毒時，將不同稀釋倍數的病毒與標準的抗血清 (20個抗體單位/單位體積）混合、孵育，使二者充分反應，然后將混合液接種到敏感宿主體內，觀察試驗結果。

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病毒中和試驗實驗方法介紹

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