新型冠狀病毒消毒效果實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
作者：百檢網(wǎng) 時(shí)間：2021-11-02 來源：互聯(lián)網(wǎng)
新型冠狀病毒消毒效果實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
1 范圍
本文件規(guī)定了消毒因子對(duì)新型冠狀病毒消毒效果實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)的基本要求、病毒滅活試驗(yàn)方法、結(jié)果評(píng)價(jià)和注意事項(xiàng)。
本文件適用于新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室消毒效果的檢測(cè)與評(píng)價(jià)。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其*新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。消毒技術(shù)規(guī)范（2002年版）衛(wèi)生部 (衛(wèi)法監(jiān)發(fā)〔2002〕282號(hào))
3 術(shù)語和定義
下列術(shù)語和定義適用于本文件。
3.1
低溫消毒 cryogenic disinfection
對(duì)溫度在0℃以下的環(huán)境或物品進(jìn)行的消毒。低溫消毒需使用在該溫度下被證明有效的消毒因子。
4 基本要求
4.1
實(shí)驗(yàn)室及人員要求
新型冠狀病毒消毒效果試驗(yàn)應(yīng)在獲得開展新型冠狀病毒培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)資格的BSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行；從事新型冠狀病毒消毒效果評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)同時(shí)具有病毒學(xué)和消毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)驗(yàn)；進(jìn)入BSL-3實(shí)驗(yàn)室的人員應(yīng)經(jīng)過生物安全的培訓(xùn)和考核，具有BSL-3實(shí)驗(yàn)室的準(zhǔn)入資格。
4.2
試驗(yàn)要求
4.2.1
實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)分懸液法病毒滅活試驗(yàn)和載體法病毒滅活試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)以懸液法病毒滅活試驗(yàn)為主，對(duì)不適宜用懸液法病毒滅活試驗(yàn)評(píng)價(jià)的消毒劑和器械，如黏稠的消毒劑、原液使用的消毒劑及紫外線等消毒器械的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)可用載體法病毒滅活試驗(yàn)。
4.2.2
實(shí)驗(yàn)室懸液病毒滅活試驗(yàn)時(shí)，有機(jī)干擾物為牛血清白蛋白。原則上對(duì)用于不經(jīng)過清洗或污染的消毒對(duì)象的消毒劑，牛血清白蛋白的濃度為 3.0%；對(duì)用于經(jīng)過清洗或較清潔的消毒對(duì)象的消毒劑，牛血清白蛋白的濃度為 0.3%；對(duì)用于經(jīng)過嚴(yán)格清洗或*清潔的消毒對(duì)象的消毒劑，可不使用有機(jī)干擾物。試驗(yàn)中病毒接觸的溶液、病毒載體等，均應(yīng)在試驗(yàn)溫度（20 ℃±1 ℃）平衡后開始試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室載體病毒滅活試驗(yàn)時(shí)使用相應(yīng)滴度的病毒培養(yǎng)液滴染載體后備用。
4.2.3
用于評(píng)估消毒因子低溫消毒效果時(shí)，應(yīng)做規(guī)定低溫條件下的消毒效果驗(yàn)證，一般采用載體法進(jìn)行。試驗(yàn)時(shí)消毒劑和病毒載體應(yīng)在低溫環(huán)境下平衡不少于 30 min 后進(jìn)行測(cè)試，其余實(shí)驗(yàn)步驟與常溫下（20 ℃±1 ℃）相同。
4.2.4
試驗(yàn)重復(fù) 3 次，重復(fù)性試驗(yàn)應(yīng)分期分批進(jìn)行。必要的器材和試劑應(yīng)重新制備或滅菌，以防產(chǎn)生系統(tǒng)性誤差。
5 病毒滅活試驗(yàn)方法
5.1
試驗(yàn)器材
5.1.1
試驗(yàn)病毒與細(xì)胞
試驗(yàn)病毒為分裝保存并確定病毒滴度的新型冠狀病毒培養(yǎng)物，細(xì)胞株為非洲綠猴腎傳代細(xì)胞（Vero-E6）或其它適合用于新型冠狀病毒增殖培養(yǎng)的細(xì)胞系。
5.1.2
有機(jī)干擾物
牛血清白蛋白。
5.1.3
試劑
消毒因子、中和劑、細(xì)胞消化液、細(xì)胞維持液和細(xì)胞培養(yǎng)液等。
5.1.4
儀器
二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、冰箱、水浴箱、II 級(jí)或 II 級(jí)以上生物安全柜等。
5.1.5
耗材
無菌帶濾芯tip頭、吸管、離心管、凍存管、試管、多孔細(xì)胞培養(yǎng)板、單道移液器、多道移液器等。
5.1.6
載體
可選用布片、玻璃片、不銹鋼片等。
5.2
細(xì)胞準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)所用Vero- E6細(xì)胞或其它細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)室常規(guī)傳代培養(yǎng)，置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養(yǎng)至單層細(xì)胞備用。
5.3
病毒懸液的制備
取出-80 ℃低溫保存的新型冠狀病毒，室溫解凍后，與設(shè)定濃度的有機(jī)干擾物混合作為消毒劑滅活試驗(yàn)用病毒懸液。
5.4
載體的制備
5.4.1
載體應(yīng)根據(jù)消毒對(duì)象選擇相應(yīng)的材料。常用的材料有布片、玻璃片、不銹鋼片等，金屬載體一般用 12 mm 直徑圓形金屬片（厚 0.5 mm），其他材質(zhì)載體一般為方形，大小 10 mm×10 mm，特定用途的消毒因子可使用其他相兼容材質(zhì)的載體。
5.4.2
所用載體于染病毒前，應(yīng)進(jìn)行脫脂處理。脫脂過程應(yīng)嚴(yán)格按照如下步驟進(jìn)行：
a)
將載體放入含洗滌劑的水中煮沸 30 min;
b)
用自來水漂洗；
c)
用蒸餾水煮沸 10 min；
d)
用蒸餾水漂洗至 pH 呈中性；
e)
晾干，備用。
5.4.3
載體經(jīng)壓力蒸汽滅菌后烘干備用，試驗(yàn)前使用滴染法染病毒懸液。
5.4.4
滴染載體的病毒滴度對(duì)數(shù)值應(yīng)≥4.0。
5.5
中和劑鑒定試驗(yàn)
5.5.1
設(shè)計(jì)原則
鑒定試驗(yàn)旨在確定所選中和劑是否適用于擬進(jìn)行的細(xì)胞感染法病毒滅活試驗(yàn)。中和劑鑒定試驗(yàn)包括預(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)，通過預(yù)試驗(yàn)確定消毒劑、中和產(chǎn)物和中和劑等對(duì)細(xì)胞生長有無影響；通過所設(shè)各組試驗(yàn)結(jié)果綜合分析，確定所用中和劑是否對(duì)測(cè)試消毒劑有良好的中和作用，對(duì)試驗(yàn)用病毒和細(xì)胞株是否有害或不良影響；中和試驗(yàn)用消毒劑濃度應(yīng)為正式消毒試驗(yàn)*高濃度，作用時(shí)間*短不得少于30 s。試驗(yàn)重復(fù)3次。
5.5.2
試驗(yàn)分組
5.5.2.1
預(yù)試驗(yàn)分組
在使用細(xì)胞感染法進(jìn)行病毒滅活試驗(yàn)時(shí)，對(duì)所用中和劑的鑒定，應(yīng)進(jìn)行以下各組預(yù)試驗(yàn)，如果中和劑與中和產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長無影響，再進(jìn)行正式試驗(yàn)。
a)
中和劑+細(xì)胞→培養(yǎng)：觀察所用中和劑對(duì)細(xì)胞的生長有無影響。
b)
（消毒劑+中和劑）+細(xì)胞→培養(yǎng)：觀察中和產(chǎn)物溶液對(duì)細(xì)胞生長有無影響。
c)
消毒劑+細(xì)胞→培養(yǎng)：觀察消毒劑對(duì)細(xì)胞生長有無影響。
在確定了中和劑與中和產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長無影響后，進(jìn)行正式試驗(yàn)。
在確定了中和劑與中和產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長無影響后，進(jìn)行正式試驗(yàn)。
5.5.2.2
正式試驗(yàn)分組
a)
中和劑+病毒懸液/病毒載體→接種細(xì)胞培養(yǎng)：觀察中和劑對(duì)病毒有無抑制作用。
b)
（消毒劑/消毒劑載體+中和劑）+病毒懸液/病毒載體→接種細(xì)胞培養(yǎng)：觀察中和產(chǎn)物，或未被完全中和的殘留消毒劑對(duì)病毒有無抑制作用或?qū)z測(cè)方法有無干擾。
c)
病毒懸液/病毒載體→接種細(xì)胞培養(yǎng)：觀察病毒是否可致細(xì)胞病變，并將該組病毒滴度對(duì)數(shù)值作為陽性對(duì)照值。
d)
未接種病毒的細(xì)胞→培養(yǎng)：觀察細(xì)胞生長是否正常。
5.5.3
操作步驟
5.5.3.1
懸液法中和劑鑒定試驗(yàn)
a)
第 1 組。試驗(yàn)體系中按病毒與中和劑（1︰4 體積比例）進(jìn)行試驗(yàn)。吸取 0.2 mL 病毒混懸液于試管內(nèi)，置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，吸取中和劑溶液 0.8 mL，混合均勻。作用 10 min，以細(xì)胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)滴度接種 4孔。置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃,5%±1% 二氧化碳）中培養(yǎng) 3-4 天。
b)
第 2 組。試驗(yàn)體系中按病毒與中和產(chǎn)物（1︰4 體積比例）進(jìn)行試驗(yàn)。吸取 0.2 mL 病毒混懸液于試管內(nèi)，置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，吸取中和產(chǎn)物溶液 0.8 mL，混合均勻。作用 10 min，以細(xì)胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)滴度接種4 孔。置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養(yǎng) 3-4 天。
c)
第 3 組。試驗(yàn)體系中按病毒與細(xì)胞維持液（1:4 體積比例）進(jìn)行試驗(yàn)。吸取 0.2 mL 病毒混懸液于試管內(nèi)，置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，吸取細(xì)胞維持液 0.8 mL，混合均勻。作用 10 min，以細(xì)胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)滴度接種4 孔。置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養(yǎng) 3-4 天。
d)
第 4 組。將試驗(yàn)用細(xì)胞，加細(xì)胞維持液后置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養(yǎng)。
5.5.3.2
載體法中和劑鑒定試驗(yàn)
a)
第 1 組。將病毒載體置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，浸入中和劑 1.0 mL，作用 10 min。充分洗脫，以細(xì)胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)滴度接種 4 孔。置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養(yǎng) 3-4 天。
b)
第 2 組。將病毒載體置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，浸入中和產(chǎn)物溶液(染有消毒劑的載體+中和劑,作用 10 min)1.0 mL，混合均勻。充分洗脫，以細(xì)胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100μL，接種于單層細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)滴度接種 4 孔。置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養(yǎng) 3-4 天。
c)
第 3 組。將病毒載體置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，浸入細(xì)胞維持液 1.0 mL，充分洗脫，以細(xì)胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)滴度接種 4 孔。置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養(yǎng) 3-4 天。
d)
第 4 組。將試驗(yàn)用細(xì)胞，加細(xì)胞維持液后置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃,5%±1%二氧化碳）中培養(yǎng)。
5.5.3.3
結(jié)果判定
試驗(yàn)結(jié)果符合以下全部條件，所測(cè)中和劑可判為合格:
a)
第 1、2、3 組病毒生長與原接種量相近；
b)
第 4 組細(xì)胞生長正常；
c)
中和劑和中和產(chǎn)物，在正式試驗(yàn)的*高濃度下對(duì)細(xì)胞生長無影響；
d)
連續(xù) 3 次試驗(yàn)取得合格評(píng)價(jià)。
5.6
病毒滅活試驗(yàn)
5.6.1
試驗(yàn)原理
用細(xì)胞感染法測(cè)定消毒因子作用前后（或?qū)φ战M與實(shí)驗(yàn)組）樣本中病毒的量。以細(xì)胞病變作為判斷指標(biāo)，確定各組病毒的感染滴度，觀察消毒因子對(duì)新型冠狀病毒的滅活效果。
5.6.2
懸液法病毒滅活試驗(yàn)
5.6.2.1
操作步驟
a)
取待測(cè)消毒劑，用滅菌硬水稀釋至所需濃度的 1.25 倍，于 20 ℃±1 ℃水浴中備用。
b)
病毒懸液的制備：取出-80 ℃低溫保存的新型冠狀病毒，室溫解凍后，與有機(jī)干擾物按照 1：1 比例混合作為消毒劑滅活試驗(yàn)用病毒懸液。
c)
消毒試驗(yàn)：取上述病毒懸液 1 份加入 4 份待檢消毒劑，立即混勻并記時(shí)。作用至規(guī)定時(shí)間，立即取出 0.1 mL，加入經(jīng)鑒定合格的 0.9 mL 中和劑中混勻；或用經(jīng)鑒定合格的除藥方法處理。
d)
對(duì)照組試驗(yàn)：陽性對(duì)照組為病毒對(duì)照組，觀察病毒生長是否良好，病毒滴度是否達(dá)到試驗(yàn)要求；陰性對(duì)照組用細(xì)胞維持液作為陰性對(duì)照，觀察有無污染，細(xì)胞生長是否良好。
e)
以上各組按照終點(diǎn)稀釋法分別進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。試驗(yàn)重復(fù) 3 次。
f)
終點(diǎn)稀釋法：用細(xì)胞維持液對(duì)待滴定樣本做 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)滴度接種 4 孔。在 36 ℃±1 ℃放置 1 h～2 h 后，取出培養(yǎng)板，更換細(xì)胞維持液。繼續(xù)放入二氧化碳培養(yǎng)箱中（36 ℃±1 ℃,5%±1% 二氧化碳）培養(yǎng) 3-4 天，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，記錄細(xì)胞病變情況。
5.6.2.2
結(jié)果判定
試驗(yàn)結(jié)果符合以下全部條件，可判為合格：
a)
陰性對(duì)照組細(xì)胞生長正常；
b)
陽性對(duì)照組病毒滴度對(duì)數(shù)值應(yīng)≥5.0；
c)
消毒試驗(yàn)組細(xì)胞無病變，與陰性對(duì)照組細(xì)胞生長情況一致。
5.6.3
載體法病毒滅活試驗(yàn)
5.6.3.1
操作步驟
a)
取待測(cè)消毒劑，置于 20 ℃±1 ℃水浴中備用。
b)
病毒載體的制備：取滅菌載體片，滴染新型冠狀病毒晾干備用。
c)
消毒試驗(yàn)：取病毒載體置于消毒因子，作用至規(guī)定的時(shí)間后取出放入經(jīng)鑒定合格的中和劑或洗脫液 1.0 mL 中，作用 10 min,混勻洗脫。消毒器械載體布點(diǎn)應(yīng)置于*難殺滅部位，具體方法參照《消毒技術(shù)規(guī)范》。
d)
對(duì)照組試驗(yàn)：陽性對(duì)照組為病毒對(duì)照組，觀察病毒生長是否良好，病毒滴度是否達(dá)到試驗(yàn)要求；陰性對(duì)照組用細(xì)胞維持液作為陰性對(duì)照，觀察有無污染，細(xì)胞生長是否良好。
e)
以上各組按照終點(diǎn)稀釋法分別進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。試驗(yàn)重復(fù) 3 次。
f)
終點(diǎn)稀釋法：用細(xì)胞維持液對(duì)待滴定樣本做 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)滴度接種 4 孔。在 36 ℃±1 ℃放置 1 h～2 h 后，取出培養(yǎng)板，更換細(xì)胞維持液。繼續(xù)二氧化碳培養(yǎng)箱中（36 ℃±1 ℃,5%±1% 二氧化碳）培養(yǎng) 3-4 天，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，記錄細(xì)胞病變情況。
5.6.3.2
結(jié)果判定
試驗(yàn)結(jié)果符合以下全部條件，可判為合格：
a)
陰性對(duì)照組細(xì)胞生長正常；
b)
陽性對(duì)照組病毒滴度對(duì)數(shù)值應(yīng)≥4.0；
c)
消毒試驗(yàn)組細(xì)胞無病變，與陰性對(duì)照組細(xì)胞生長情況一致。
6 結(jié)果評(píng)價(jià)
同時(shí)符合下列a)和b)的消毒因子判為消毒效果合格：
a)
去除殘留消毒劑效果的中和劑鑒定試驗(yàn)合格；
b)
懸液滅活試驗(yàn)，每次試驗(yàn)對(duì)新型冠狀病毒應(yīng)有效滅活，陽性對(duì)照組病毒滴度對(duì)數(shù)值應(yīng)≥5.0 或載體滅活試驗(yàn)，每次試驗(yàn)對(duì)新型冠狀病毒應(yīng)有效滅活，陽性對(duì)照組病毒滴度對(duì)數(shù)值應(yīng)≥4.0。
7 注意事項(xiàng)
7.1
實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)嚴(yán)格按照 BSL-3 實(shí)驗(yàn)室個(gè)人防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程要求做好個(gè)人防護(hù)。建議參與實(shí)驗(yàn)的人員進(jìn)行新型冠狀病毒疫苗接種。
7.2
涉及新型冠狀病毒活病毒的操作應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行 BSL-3 實(shí)驗(yàn)室的生物安全相關(guān)規(guī)定。
7.3
無菌器材使用前需檢查包裝是否完整，有破損者不得使用。
7.4
消毒試驗(yàn)所用的細(xì)胞培養(yǎng)基和試劑等均需無菌。
7.5
實(shí)驗(yàn)活動(dòng)涉及新型冠狀病毒活病毒的操作，應(yīng)在 BSL-3 實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過程中若發(fā)生溢灑等意外情況時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照 BSL-3 實(shí)驗(yàn)室意外情況應(yīng)急處置操作規(guī)程等進(jìn)行安全處置。
7.6
實(shí)驗(yàn)廢棄物應(yīng)按照相應(yīng)廢棄物處置操作規(guī)程進(jìn)行安全處置。
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