1.范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定規(guī)范性引用文件。

2.規(guī)范性引用文件

本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件,其*新版本(包括所有的修改單)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.原理

利用植物乳桿菌(Lactobacillus plantarun)對游離生物素的特異性和靈敏性,定量測定出試樣中待測物質(zhì)的含量。在含有除待測物質(zhì)以外所有營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中,微生物的生長與待測物質(zhì)含量呈線性關(guān)系,根據(jù)透光率與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行比較,即可計算出試樣中待測物質(zhì)的含量。

4.試劑和材料

除非另有規(guī)定,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T 6682規(guī)定的二級水。

4.1 菌株:植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum),ATCC 8014。

4.2 生物素(d-Biotin或Vitamin H)標(biāo)準(zhǔn)品(C10H16N2O3S):純度≥99%。

4.3 培養(yǎng)基

4.3.1 乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基:見附錄A。

4.3.2 乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基:見附錄A。

4.3.3 生物素測定用培養(yǎng)基:見附錄A。

注:一些商品化合成培養(yǎng)基效果良好,商品化合成培養(yǎng)基按標(biāo)簽說明進(jìn)行配制。

4.4 乙醇溶液(50%)。

4.5 硫酸溶液(3%):量取3mL硫酸加入到水中,定容至100mL。

4.6 氫氧化鈉溶液(0.5mol/L):稱取20g氫氧化鈉溶于1000mL水中。

4.7 氯化鈉溶液(9g/L):稱取9.0g氯化鈉溶解于1000mL水中,分裝試管,每管10mL。121℃滅菌15min。

4.8 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

4.8.1 生物素標(biāo)準(zhǔn)貯備液(100μg/mL):稱取生物素標(biāo)準(zhǔn)品(4.2)用乙醇溶液(4.4)定容至生物素濃度為100μg/mL,貯于冰箱中。

4.8.2 生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液(lμg/mL):吸取1mL生物素標(biāo)準(zhǔn)貯備液(4.8.1),用乙醇溶液(44)定容至100mL。

4.8.3 生物素標(biāo)準(zhǔn)工作液(10ng/mL):吸取1mL生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液(4.8.2),用乙醇溶液(4.4)定容至100mL。

4.8.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液

分兩個濃度,高濃度溶液的濃度為0.2ng/mL;低濃度溶液的濃度為0.lng/mL。從工作液中(4.8.3)吸取兩次各5mL,用水分別定容到250mL和500mL。

注:所有標(biāo)準(zhǔn)溶液要儲存于冰箱內(nèi)。4.8.1、4.8.2、和4.8.3保存期三個月,4.8.4臨用前配制。

5.儀器和設(shè)備

除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下：

5.1 天平:感量為0.1mg。

5.2 pH計:精度≤0.02。

5.3 分光光度計。

5.4 渦旋混合器。

5.5 離心機:轉(zhuǎn)速≥2000轉(zhuǎn)/分鐘。

5.6 恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃。

5.7 冰箱:2℃～5℃。

5.8 無菌吸管:10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器或吸頭。

5.9 瓶口分液器:0mL～10mL。

5.10 錐形瓶:200mL。

5.11 容量瓶(A類):100mL,250mL,500mL。

5.12 單刻度移液管(A類):容量5mL。

5.13 漏斗:直徑90mm。

5.14 定量濾紙:直徑90mm。

5.15 試管:18mm×180mm。

注:玻璃儀器使用前,用活性劑〔月桂磺酸鈉或家用洗滌劑加入到洗滌用水中即可)對硬玻璃測定管及其他必要的玻璃器皿進(jìn)行清洗,清洗之后在200℃干熱2h。

6.分析步驟

6.1 接種菌懸液的制備

6.1.1 將凍干菌株(4.1)活化后,轉(zhuǎn)接到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基(4.3.1)中,36℃±1℃培養(yǎng)過夜。再轉(zhuǎn)接2～3代來增強活力。然后再將其從固體培養(yǎng)上轉(zhuǎn)接到乳酸杄菌肉湯培養(yǎng)基(4.3.2)中培養(yǎng)。

6.1.2 將乳酸桿菌肉湯中的培養(yǎng)液以2000轉(zhuǎn)/分鐘離心2min～3min,傾出上清液,加入10mL氯化鈉溶液(4.7),混勻,再離心2min～3min,如此清洗3次～4次,吸適量該菌懸液于10mL鹽水(4.7)中,待測。

6.1.3 用分光光度計以氯化鈉溶液(4.7)做空白,于550nm波長下測菌懸液(6.1.2)的透光率,使其透光率在60%～80%之間。

6.2 樣品的處理

6.2.1 干粉樣品

稱取一定量樣品(精確至0.0001g)于250mL三角瓶中,該樣品應(yīng)含0.2μg～0.5μg生物素。繼續(xù)6.2.3步驟。

6.2.2 液體樣品

吸一定量的液體樣品于250mL三角瓶中,該樣品應(yīng)含0.2μg～0.5μg生物素。繼續(xù)6.2.3步驟。

6.2.3樣品的提取

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