1.范圍

本標準規定了嬰幼兒食品和乳品中葉酸(葉酸鹽活性)的測定方法。

本標準適用于嬰幼兒食品和乳品中葉酸(葉酸鹽活性)的測定。

2.規范性引用文件

本標準中引用的文件對于本標準的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅所注日期的版本適用于本標準。凡是不注日期的引用文件,其*新版本(包括所有的修改單)適用于本標準。

3.原理

利用干酪乳桿菌( Lactobacillus casei)ATCC 7469對葉酸的特異性,在含有葉酸的樣品中生長產生的酸度和形成的光密度來測定葉酸的含量。

4.試劑和材料

除非另有規定,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T 6682規定的二級水。

4.1 雞胰腺:稱取100mg干燥的雞胰腺,加20mL蒸餾水,攪拌15min,離心10min(3000轉分鐘),取上清液,臨用前配制。

4.2 0.9%生理鹽水:稱取9.0g氯化鈉溶解于100mn水中,分裝于具塞試管中,每管10mL,121℃滅菌15min。每周準備一次。

4.3 磷酸鹽緩沖液

4.3.1 磷酸鹽緩沖液Ⅰ(0.05mol/L):稱取5.85g磷酸二氫鉀,1.22g磷酸氫二鉀,用1000mnL水溶解。臨用前按0.5g/100mL加入抗壞血酸。

4.3.2 磷酸鹽緩沖液Ⅱ(用于谷物及谷物制品前處理):稱取14.2g磷酸氫二鈉,用1000mL水溶解。臨用前按1.0g/100mL加入抗壞血酸,用氫氧化鈉溶液A(4.16)調pH至7.8±0.1。

4.3.3 磷酸鹽緩沖液Ⅲ(用于谷物及谷物制品測試):稱取14.2g磷酸氫二鈉,用1000mnL水溶解。臨用前按1.0g/100mL加入抗壞血酸,用氫氧化鈉溶液A(4.16)調pH至6.8±0.1。

4.3.4 磷酸鹽緩沖液Ⅳ(0.1 mol/L)(用于谷物及谷物制品標準溶液制備):溶解13.61g磷酸二氫鉀于水中稀釋到1000mL。用氫氧化鉀溶液(4.10)調pH至7.0±0.1。

4.4 葉酸標準品。

4.5 氨水(10.8%)

4.6 甲苯(C7H8)。

4.7 抗壞血酸(C6H8O6)。

4.8 菌株:干酪乳桿菌( Lactobacillus casei)ATCC 7469。

4.9 培養基

4.9.1 乳酸桿菌瓊脂培養基:胨化乳15g,酵母浸膏5g,葡萄糖10g,番茄汁100mL,磷酸二氫鉀2g,聚山梨糖單油酸酯1g,瓊脂10g,加蒸餾水至1000mL,調pH至68±0.2(20℃～25℃)。121℃高壓滅菌15min,備用。

4.9.2 乳酸桿菌肉湯培養基:胨化乳15g,酵母浸膏5g,葡萄糖10g,番茄汁100mL,磷酸二氫鉀2g,聚山梨糖單油酸酯1g,加蒸餾水至1000mnL,調pH至68±02(20℃～25℃)。121℃高壓滅菌15min,備用。

4.9.3 葉酸測定用培養基:酪蛋白胨10g,葡萄糖40g,乙酸鈉40g,磷酸氫二鉀1g,磷酸二氫鉀1g,DL-色氨酸0.2g,L-天門冬氨酸0.6g,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g,硫酸腺嘌呤10mg,鹽酸鳥嘌呤10mg,尿嘧啶10mg,黃嘌呤20mg,聚山梨糖0.1g,谷光甘肽5mg,硫酸鎂0.4g,氯化鈉20mg,硫酸亞鐵20mg,硫酸錳15mg,核黃1mg,p-氨基苯甲酸2mg,維生素B6 4mg,鹽酸硫胺素400μg,泛酸鈣800μg,煙酸800μg,生物素20μg,加蒸餾水至1000mnL,調pH至6.7±0.1(20℃～25℃)。

注:市售商業化合成培養基效果更穩定。

4.10 氫氧化鉀溶液(4mol/L):稱取224g氫氧化鉀于1000mL燒杯中,用400mL水溶解,冷卻至室溫后,轉移至1000mnL容量瓶中,用水定容。

4.11 木瓜蛋白酶溶液:1g蛋白酶(活力≥6000U/mg,pH6.0±0.1,40℃)溶于100mL磷酸鹽緩沖液Ⅰ(4.3.1)中。臨用前配制。

4.12 α-淀粉酶溶液:1gα-淀粉酶(1.5U/mg)溶于l00mL磷酸鹽緩沖液Ⅰ(4.3.1)中。臨用前配制。

4.13 0.22μm滅菌濾膜。

4.14 標準溶液的制備

4.14.1 葉酸標準貯備液(500μg/mL):稱取55mg～56mg(精確至0.lmg)葉酸標準品(4.4),用50mL蒸餾水轉入100mL容量瓶中,加2mL氨水(4.5)。溶液制備后,按式(1)計算溶液的體積,要求貯備液中葉酸鹽的濃度為500μg/mL:

用水稀釋溶液至刻度,用吸管加水至計算要求的體積,充分混合,放入棕色試劑瓶中2℃～4℃冰箱冷藏,保存期為4個月。

4.14.2 葉酸標準中間液(50μg/mL):吸取10mL葉酸標準貯備液(4.14.1)于100mL棕色容量瓶中,用水定容至刻度,充分混勻,2℃～4℃冰箱冷藏,保存期為1個月。

4.14.3 葉酸標準工作液(0.05ng/mL,0.1ng/mL):吸取1mL葉酸標準中間液(4.14.2)于100mL棕色容量瓶中,用水定容至刻度,混合。再吸該液1mL于100mL棕色容量瓶中,定容,混合。從上液中分別吸取5mL于250mL和500mL棕色容量瓶中,用磷酸鹽緩沖液Ⅰ(4.3.1)定容到刻度,混勻,即為高濃度標準工作液(0.1ng/mL)和低濃度標準工作液(0.05ng/mL)。臨用前配制。

4.15 鹽酸(1mol/L):量取83.0mL鹽酸溶于水中,冷卻后定容至1000mnL。

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