1.范圍

本標準規定了嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定方法。

本標準適用于嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定。

2.規范性引用文件

本標準中引用的文件對于本標準的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅所注日期的版本適用于本標準。凡是不注日期的引用文件,其*新版本(包括所有的修改單)適用于本標準。

3.原理

利用萊士曼氏乳酸桿菌( Lactobacillus leichmannii)對維生素B12的特異性和靈敏性,定量測定出試樣中維生素B12的含量。在測定用培養基中供給除維生素B1以外的所有營養成分,這樣微生物生長產生的透光率就會同標準曲線工作液及未知待測溶液中維生素B12的含量相對應。以不同濃度標準溶液的透光率相對于各濃度水平標準物質的濃度繪制標準曲線,根據標準曲線即可計算出試樣中維生素B12的含量。

4.試劑和材料

除非另有規定,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T 6682規定的二級水。

4.1 菌株:萊士曼氏乳酸桿菌( Lactobacillus leichmannii)ATCC 7830。

4.2 維生素B12( Vitamin B12或 Cyanocobalamin)標準品:分子式C63H88CON14O14P,純度≥99%。

4.3 培養基

4.3.1 乳酸桿菌瓊脂培養基:見附錄A。

4.3.2 乳酸桿菌肉湯培養基:見附錄A。

4.3.3 維生素B12測定用培養基:見附錄A。

注:一些商品化合成培養基效果良好,商品化合成培養基按標簽說明進行配制。

4.4 9g/L氯化鈉溶液(生理鹽水)

稱取9.0g氯化鈉溶解于1000mL水中,分裝于具塞試管,每管10mL。121℃滅菌15min。

4.5 乙醇溶液:體積分數為25%。

4.6 無水磷酸氫二鈉(Na2HPO4)。

4.7 無水偏重亞硫酸鈉(Na2S2O5)。

4.8 檸檬酸(含一個結晶水)(C6H8O7·H2O)。

4.9 標準溶液的制備

4.9.1 維生素B12貯備液(10μg/mL):精確稱取維生素B12標準品(4.2),用乙醇溶液(4.5)定容至維生素B12濃度為10μg/mL。

4.9.2 維生素B12中間液(100ng/mL):用乙醇溶液(4.5)將5.0mL維生素B12貯備液(4.9.1)定容至500mL。

4.9.3 維生素B12工作液(1ng/mL):用乙醇溶液(4.5)將5.0mL維生素B12中間液(4.9.2)定容至500mL

4.9.4 標準曲線工作液:分別吸取兩個5mL維生素B12工作液(4.9.3)于250mL和500mL容量瓶中,用水定容至刻度。高濃度溶液的濃度為0.02ng/mL;低濃度溶液的濃度為0.01ng/mL。

注:所有標準溶液要儲存于冰箱內。4.9.1、4.9.2和4.9.3保存期三個月,4.9.4臨用前配制。

5.儀器和設備

除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下：

5.1 天平:感量為0.1mg。

5.2 pH計:精度≤0.01。

5.3 分光光度計。

5.4 渦旋混合器。

5.5 離心機:轉速≥2000轉/分鐘。

5.6 恒溫培養箱:36℃±1℃。

5.7 冰箱:2℃～5℃。

5.8 無菌吸管:10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器和吸頭。

5.9 瓶口分液器:0mL～10mL。

5.10 錐形瓶:200mL。

5.11 容量瓶(A類):100mL,250mL,500mL。

5.12 單刻度移液管(A類):容量5mL。

5.13 漏斗:直徑90mm。

5.14 定量濾紙:直徑90mm。

5.15 試管:18mm×180mm。

注:準備玻璃儀器時,使用活性劑對硬玻璃測定管及其他必要的玻璃器皿進行清洗,清洗之后要求在200℃干熱2h。

6.分析步驟

6.1 測試菌液的制備

6.1.1 將萊士曼氏乳酸杄菌(ATCC 7830)的凍干菌株(4.1)活化后,接種到乳酸桿菌瓊脂培養基(4.3.1)上,36℃±1℃培養24h。再轉種2代～3代來增強活力。置2℃～5℃冰箱保存備用。每15d轉種一次。

6.1.2 將活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養基(43.2)中,36℃±1℃培養18h～24h,以2000轉/分鐘離心2min～3min,棄去上清液,加入10mL生理鹽水(4.4),混勻,再離心2min～3min,棄去上清液,再加入10mL生理鹽水(4.4),混勻。如前離心操作,棄去上清液。再加10mL生理鹽水(4.4),混勻。吸適量該菌懸液于10nL生理鹽水(4.4)中,混勻制成測試菌液。

6.1.3 用分光光度計(5.3),以生理鹽水(4.4)做空白,于550nm波長下測測試菌液(6.1.2)的透光率,使其透光率在60%～80%之間。

6.2 試樣的處理

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