1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了采用高效液相色譜法測(cè)定花生黃曲霉毒素B1含量的方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于花生中黃曲霉毒素B1的測(cè)定。

本方法檢出限為1.0μg/kg。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的*新版本。凡是不注日期的引用文件，其*新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

GB 5491 糧食、油料檢驗(yàn)扦樣、分樣法

GB 6682 實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)定(GB 6682-1992，eqv ISO 3696-1987)

3 原理

樣品中黃曲霉毒素B1經(jīng)提取濃縮、衍生化，反相C18柱分離后，在激發(fā)波長(zhǎng)365mm，熒光波長(zhǎng)440nm檢測(cè)，外標(biāo)法定量，計(jì)算樣品黃曲霉毒素B1含量。

4 試劑

下列試劑除注明外均為分析純，水為GB 6682 規(guī)定的二級(jí)水。

4.1 甲醇，色譜純。

4.2 乙腈，色譜純。

4.3 甲醇溶液(含4%氯化鈉)，稱取4g氯化鈉(NaCl)溶于70mL甲醇和30mL水的混合溶液。

4.4 三氟乙酸。

4.5 石油醚(60℃~90℃)。

4.6 三氯甲烷。

4.7 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，10mg/L。

5 儀器設(shè)備

5.1 天平，感量±1mg。

5.2 切片機(jī)。

5.3 粉碎機(jī)。

5.4 旋渦混合器。

5.5 超聲波清洗器，功率不低于50W。

5.6 干熱氮吹儀，控溫精度50℃±2℃。

5.7 中速定性濾紙。

5.8 烘箱，控溫精度50℃±2℃。

5.9 0.45μm有機(jī)相濾膜。

5.10 Nova-pak C18色譜柱(3.9mm×150mm)。

5.11 液相色譜儀(帶熒光檢測(cè)器)。

6 取樣

按GB 5491 執(zhí)行。

7 試樣的制備

樣品中的水分及揮發(fā)物含量超過10%時(shí)，在45℃左右的條件下通風(fēng)干燥。將干燥的花生樣品在切片機(jī)中切片至0.5mm左右，再經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過0.42mm篩。

8 分析步驟

8.1 提取

稱取20g(精確至10mg)樣品，置于250mL具塞錐形瓶中，加60mL甲醇溶液(4.3)。50℃±2℃水浴超聲提取5min(每隔1min取出旋渦混合1次)，過雙層中速定性濾紙(5.7)，收集濾液于小燒杯中取濾液10mL于試管a中，加入5mL石油醚(4.5)，旋渦混合30s，靜置2min，待分層后，棄上層，取下層溶液5mL于試管b中，加入5mL三氯甲烷(4.6)至試管b中，旋渦混合10s，靜置2min，取出上層于試管c中，再加入5mL三氯甲烷(4.6)至試管b中，旋渦混合10s，靜置2min，取上層。合并兩次提取液于試管c中。

8.2 柱前衍生

將提取液置于干熱氮吹儀(5.6)50℃恒溫吹干，加入200μL衍生試劑(4.4)，蓋好塞子，旋渦混合30s，50℃烘箱中衍生5min，置于干熱氮吹儀(5.6)50℃恒溫吹干，用1mL流動(dòng)相溶解，過有機(jī)相濾膜(5.9)，濾液用液相色譜分析。

8.3 色譜分析

8.3.1 取黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(4.7)，用甲醇(4.1)稀釋至20μg/L、40μg/L、80μg/L、160μg/L、320μg/L標(biāo)準(zhǔn)使用液連同樣品依次進(jìn)樣，進(jìn)行液相色譜檢測(cè)，建立工作曲線。

8.3.2 色譜條件：流動(dòng)相：乙腈+甲醇+水=13+12+75，流速：0.8mL/min，進(jìn)樣量10μL，柱溫30℃，檢測(cè)器：EX：365nm，F(xiàn)M：440nm

9 結(jié)果計(jì)算

試樣中黃曲霉毒素B1含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)W計(jì)單位以微克每千克表示(g/kg)，按公式(1)計(jì)算：

W=m1×V1xD/V2×1000x1000/m? ? ? ? ? （1）

式中：

m1——從工作曲線上計(jì)算出進(jìn)樣體積樣品中黃曲霉毒素B1質(zhì)量，單位為微克(pg)；

V1——加入流動(dòng)相體積的數(shù)值，單位為毫升(mL)；

V2——進(jìn)樣體積，單位為微升(L)；

D——樣液的總稀釋倍數(shù)；

m——試樣質(zhì)量，單位為克(g)。

計(jì)算結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后一位。

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