1 范圍

SN/T 3084 的本部分規(guī)定了化妝品眼刺激性角膜細(xì)胞試驗(yàn)方法。

本部分適用于化妝品原料和成品眼刺激性體外篩選試驗(yàn)。

本部分適用于部分化妝品使用的表面活性劑的篩選測(cè)試。

本部分可作為眼刺激性動(dòng)物試驗(yàn)的替代方法之一。可以結(jié)合其他眼刺激替代試驗(yàn)，對(duì)眼刺激效應(yīng)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

本部分可作為其他領(lǐng)域眼刺激體外測(cè)試的參考方法。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其*新版本(包括所有的修改單)適用于本文件

SN/T 2285 化妝品體外替代試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室規(guī)范

3 術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1 眼刺激性 eye irritation

眼球表面接觸受試樣品后產(chǎn)生的可逆性炎性變化。

3.2 SIRC細(xì)胞系 statens seruminstitut rabbit cornea cell line

來(lái)源于兔眼角膜組織的成纖維細(xì)胞系。

3.3 STE試驗(yàn) short time exposure test

采用SIRC細(xì)胞進(jìn)行的短時(shí)間暴露試驗(yàn)，本部分指5min暴露試驗(yàn)。

4 原理

本試驗(yàn)采用來(lái)源于眼刺激靶器官的SIRC細(xì)胞系，將樣本干預(yù)細(xì)胞5min，然后去除。采用CCK-8細(xì)胞毒性測(cè)試法( cell counting kit-8 cytotoxicity test)，使干預(yù)后的細(xì)胞與CCK-8試劑反應(yīng)，活細(xì)胞線(xiàn)粒體中的脫氫酶會(huì)將CCK-8試劑還原成橙黃色的甲臢染料，活細(xì)胞越多，被還原成的染料越多，顏色深淺與細(xì)胞數(shù)目呈線(xiàn)性關(guān)系。通過(guò)測(cè)定波長(zhǎng)450nm時(shí)的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞的生存率，判斷樣品的眼刺激性。本部分為STE短時(shí)暴露試驗(yàn)，適用于不同溶解性狀的樣本。

5 儀器與試劑耗材

5.1 儀器

5.1.1 Ⅱ級(jí)生物安全柜。

5.1.2 二氧化碳培養(yǎng)箱：溫度37℃±1℃，濕度90%±5%，5%±1%CO2濃度。

5.1.3 恒溫水浴箱：溫度37℃±1℃。

5.1.4 倒置顯微鏡。

5.1.5 酶標(biāo)儀。

5.1.6 電子大平：0.1mg量程。

5.1.7 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或血球計(jì)數(shù)器。

5.1.8 離心機(jī)。

5.1.9 混懸儀。

5.1.10 真空吸液泵。

5.1.11 程序降溫儀。

5.1.12 液氮罐。

5.1.13 5μL~50μL，10μL~100μL，20μL~200μL量程排槍。

5.1.14 細(xì)胞凍存盒。

5.2 試劑耗材

5.2.1 MEM培養(yǎng)基( minimum essential medium)

5.2.2 胎牛血清(FBS)：56℃加熱滅30min。

5.2.3 0.25%胰酶/EDTA溶液(Trypsin/EDTA)：0.25%胰酶溶液與0.02 mol/L EDTA溶液1：1混均。

5.2.4 青霉素/鏈霉素雙抗：工作溶液青霉素(100U/mL鏈霉素(100μg/mL)。

5.2.5 MEM完全培養(yǎng)基：含10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL霉素。

5.2.6 二甲基亞砜(DMSO)。

5.2.7 細(xì)胞凍存培養(yǎng)基：含20%FBS、10%DMSO的MEM培養(yǎng)基。

5.2.8 磷酸鹽緩沖液(PBS)。

5.2.9 礦物油：細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)。

5.2.10 0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)：稱(chēng)取0.01gSDS于10mL無(wú)菌試管中，加入PBS至10mL。

5.2.11 5%吐溫20(TWEEN20)：稱(chēng)取0.5 g TWEEN20于10mL無(wú)菌試管中，加入PBS至10mL。

5.2.12 CCK-8試劑。

5.2.13 50mL無(wú)菌離心管。

5.2.14 無(wú)菌吸管(5mL，10mL)。

5.2.15 10mL無(wú)菌試管。

5.2.16 細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板：25cm2、75cm2培養(yǎng)瓶：96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板。

6 試驗(yàn)方法

6.1 基本要求

試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)符合SN/T 2285 的要求。為保證溯源性，SIRC細(xì)胞應(yīng)由有資質(zhì)的細(xì)胞庫(kù)提供，選擇0代之內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。所有細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)操作步驟都應(yīng)在Ⅱ級(jí)生物安全柜里進(jìn)行，確保無(wú)菌操作。

6.2 細(xì)胞培養(yǎng)

6.2.1 SIRC細(xì)胞培養(yǎng)

購(gòu)置的SIRC細(xì)胞，更換MEM完全培養(yǎng)基，在37℃±1℃，濕度90%±5%，CO2濃度5.0%±1%條件下進(jìn)行培養(yǎng)(后續(xù)試驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)均按此條件)。

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