1.范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中肉毒梭菌( Clostridium botulinum)及肉毒毒素( botulinum toxin)的檢驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗(yàn)。

2.設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下：

2.1 冰箱:2℃～5℃、-20℃。

2.2 天平:感量0.1g。

2.3 無菌手術(shù)剪、鑷子、試劑勺。

2.4 均質(zhì)器或無菌乳缽。

2.5 離心機(jī):3000r/min、14000r/min。

2.6 厭氧培養(yǎng)裝置。

2.7 恒溫培養(yǎng)箱:35℃±1℃、28℃±1℃。

2.8 恒溫水浴箱:37℃±1℃、60℃±1℃、80℃±1℃。

2.9 顯微鏡:10倍～100倍。

2.10 PCR儀。

2.11 電泳儀或毛細(xì)管電泳儀。

2.12 凝膠成像系統(tǒng)或紫外檢測儀。

2.13 核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。

2.14 可調(diào)微量移液器:0.2μL～2μL、2μL～20μL、20μL～200μL、100μL～1000μL。

2.15 無菌吸管:1.0mL、10.0mL、25.0mL。

2.16 無菌錐形瓶:100mL。

2.17 培養(yǎng)皿:直徑90mm。

2.18 離心管:50mL、1.5mL。

2.19 PCR反應(yīng)管。

2.20 無菌注射器:1.0mL。

2.21 小鼠:15g～20g,每一批次試驗(yàn)應(yīng)使用同一品系的KM或ICR小鼠。

3.培養(yǎng)基和試劑

除另有規(guī)定外,PCR試驗(yàn)所用試劑為分析純或符合生化試劑標(biāo)準(zhǔn),水應(yīng)符合GB/T 6682中一級水的要求。

3.1 庖肉培養(yǎng)基:見A.1。

3.2 胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉湯( TPGYT):見A.2。

3.3 卵黃瓊脂培養(yǎng)基:見A.3。

3.4 明膠磷酸鹽緩沖液:見A.4。

3.5 革蘭氏染色液:見A.5。

3.6 10%胰蛋白酶溶液:見A.6。

3.7 磷酸鹽緩沖液(PBS):見A.7。

3.8 1mol/L氫氧化鈉溶液。

3.9 1mol/L鹽酸溶液。

3.10 肉毒毒素診斷血清。

3.11 無水乙醇和95%乙醇。

3.12 10mg/mL溶菌酶溶液。

3.13 10mg/mL蛋白酶K溶液。

3.14 3mol/L乙酸鈉溶液(pH5.2)。

3.15 TE緩沖液

3.16 引物:根據(jù)表1中序列合成,臨用時用超純水配制引物濃度為10μmol/L。

3.1710×PCR緩沖液

31825mmol/ L MgCl2。

3.19 dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。

3.20 Taq酶。

3.21 瓊脂糖:電泳級。

3.22 溴化乙錠或 Goldview。

3.23 5×TBE緩沖液。

3.24 6×加樣緩沖液。

3.25 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

4.檢驗(yàn)程序

肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗(yàn)程序見圖1。

5.操作步驟

5.1 樣品制備

5.1.1 樣品保存

待檢樣品應(yīng)放置2℃～5℃冰箱冷藏。

5.1.2 固態(tài)與半固態(tài)食品

固體或游離液體很少的半固態(tài)食品,以無菌操作稱取樣品25g,放入無菌均質(zhì)袋或無菌乳缽,塊狀食品以無菌操作切碎,含水量較髙的固態(tài)食品加入25mL明膠磷酸鹽緩沖液,乳粉、牛肉干等含水量低的食品加入50mL明膠磷酸鹽緩沖液，浸泡30min，用拍擊式均質(zhì)器拍打2min或用無菌研杵研磨制備樣品勻液，收集備用。

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