1.范圍

本標準規定了食品中副溶血性弧菌( Vibrio parahaemolyticus)的檢驗方法。

本標準適用于食品中副溶血性弧菌的檢驗。

2.設備和材料

除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下:

a) 恒溫培養箱:36℃±1℃;

b) 冰箱:2℃～5℃、7℃～10℃;

c) 恒溫水浴箱:36℃±1℃;

d) 均質器或無菌乳缽;

e) 天平:感量0.1g;

f) 無菌試管:18mm×180mm、15mm×100mm;

g )無菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭;

h) 無菌錐形瓶:容量250mL、500mL、1000mL;

i) 無菌培養皿:直徑90mm；

j) 全自動微生物生化鑒定系統；

k) 無菌手術剪、鑷子；

3.培養基和試劑

3.1 3%氯化鈉堿性蛋白胨水:見附錄A中A.1。

3.2 硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖(TCBS)瓊脂:見附錄A中A2。

3.3 3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂:見附錄A中A.3。

3.4 3%氯化鈉三糖鐵瓊脂:見附錄A中A4。

3.5 嗜鹽性試驗培養基:見附錄A中A.5。

3.6 3%氯化鈉甘露醇試驗培養基:見附錄A中A6。

3.7 3%氯化鈉賴氨酸脫羧酶試驗培養基:見附錄A中A.7。

3.8 3%氯化鈉MR-VP培養基:見附錄A中A8。

3.9 3%氯化鈉溶液:見附錄A中A9。

3.10 我妻氏血瓊脂:見附錄A中A.10。

3.11 氧化酶試劑:見附錄A中A.11。

3.12 革蘭氏染色液:見附錄A中A.12。

3.13 ONPG試劑:見附錄A中A.13。

3.14 Voges-Proskauer(V-P)試劑:見附錄A中A.14。

3.15 弧菌顯色培養基。

3.16 生化鑒定試劑盒。

4.檢驗程序

副溶血性弧菌檢驗程序見圖1。

5.操作步驟

5.1 樣品制備

5.1.1 非冷凍樣品采集后應立即置7℃～10℃冰箱保存,盡可能及早檢驗;冷凍樣品應在45℃以下不超過15min或在2℃～5℃不超過18h解凍。

5.1.2 魚類和頭足類動物取表面組織、腸或鰓。貝類取全部內容物,包括貝肉和體液;甲殼類取整個動物,或者動物的中心部分,包括腸和鰓。如為帶殼貝類或甲殼類,則應先在自來水中洗刷外殼并甩干表面水分,然后以無菌操作打開外殼,按上述要求取相應部分。

5.1.3 以無菌操作取樣品25g(mL),加入3%氯化鈉堿性蛋白胨水225mL,用旋轉刀片式均質器以8000r/min均質lmin,或拍擊式均質器拍擊2min,制備成1:10的樣品勻液。如無均質器,則將樣品放入無菌乳缽,225mL3%氯化鈉堿性蛋白胨水中取少量稀釋液加入無菌乳缽,樣品磨碎后放入500mL無菌錐形瓶,再用少量稀釋液沖洗乳缽中的殘留樣品1~2次,洗液放入錐形瓶,*后將剩余稀釋液全部放入錐形瓶,充分振蕩,制備1:10的樣品勻液。

5.2 增菌

5.2.1 定性檢測

將5.13制備的1:10樣品勻液于36℃±1℃培養8h～18h。

5.2.2 定量檢測

5.2.2.1 用無菌吸管吸取1:10樣品勻液1mL,注入含有9mL3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內,振搖試管混勻,制備1:100的樣品勻液。

5.2.2.2 另取lm無菌吸管,按5.2.2.1操作程序,依次制備10倍系列稀釋樣品勻液,每遞增稀釋次,換用一支1mL無菌吸管。

5.2.2.3 根據對檢樣污染情況的估計,選擇3個適宜的連續稀釋度,每個稀釋度接種3支含有9mL3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管,每管接種1mL。置36℃±l℃恒溫箱內,培養8h～18h。

5.3 分離

5.3.1 對所有顯示生長的增菌液,用接種環在距離液面以下1cm內沾取一環增菌液,于TCBS平板或弧菌顯色培養基平板上劃線分離。一支試管劃線一塊平板。于36℃±1℃培養18h～24h。

5.3.2 典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落,用接種環輕觸,有類似口香糖的質感,直徑2mm~3mm。從培養箱取岀T℃BS平板后,應盡快(不超過lh)挑取菌落或標記要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌顯色培養基上的特征按照產品說明進行判定。

5.4 純培養

挑取3個或以上可疑菌落,劃線接種3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板,36℃±1℃培養18h～24h。

5.5 初步鑒定

5.5.1 氧化酶試驗:挑選純培養的單個菌落進行氧化酶試驗,副溶血性弧菌為氧化酶陽性。

5.5.2 涂片鏡檢:將可疑菌落凃片,進行革蘭氏染色,鏡檢觀察形態。副溶血性弧菌為革蘭氏陰性,呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態,無芽胞,有鞭毛。

5.5.3 挑取純培養的單個可疑菌落,轉種3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層,36℃C±1℃培養24h觀察結果。副溶血性弧菌在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應為底層變黃不變黑,無氣泡,斜面顏色不變或紅色加深,有動力。

5.5.4 嗜鹽性試驗:挑取純培養的單個可疑菌落,分別接種0%、6%、8%和10%不同氯化鈉濃度的胰胨水,36℃±1℃培養24h,觀察液體混濁情況。副溶血性弧菌在無氯化鈉和10%氯化鈉的胰胨水中不生長或微弱生長,在6%氯化鈉和8%氯化鈉的胰胨水中生長旺盛。

5.6 確定鑒定

更多標準內容點擊以下鏈接獲取標準全文：

下載地址：《GB 4789.7-2013 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》