1.范圍

本標準規定了食品中大腸菌群( Coliforms)計數的方法。

本標準**法適用于大腸菌群含量較低的食品中大腸菌群的計數;第二法適用于大腸菌群含量較高的食品中大腸菌群的計數。

2.術語和定義

2.1 大腸菌群 Coliforms

在一定培養條件下能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。

2.2 *可能數 Most probable number;MPN

基于泊松分布的一種間接計數方法。

3.檢驗原理

3.1 MPN法

MPN法是統計學和微生物學結合的一種定量檢測法。待測樣品經系列稀釋并培養后,根據其未生長的*低稀釋度與生長的*高稀釋度,應用統計學概率論推算岀待測樣品中大腸菌群的*大可能數。

3.2平板計數法

大腸菌群在固體培養基中發酵乳糖產酸,在指示劑的作用下形成可計數的紅色或紫色,帶有或不帶有沉淀環的菌落。

4.設備和材料

除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下：

4.1 恒溫培養箱:36℃±1℃C。

4.2 冰箱:2℃～5℃

4.3 恒溫水浴箱:46℃±1℃

4.4 天平:感量0.1g。

4.5 均質器。

4.6 振蕩器。

4.7 無菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。

4.8 無菌錐形瓶:容量500mL。

4.9 無菌培養皿:直徑90mm。

4.10 pH計或pH比色管或精密pH試紙。

4.11 菌落計數器。

5.培養基和試劑

5.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨( lauryl sulfate tryptose,LST)肉湯:見A.1。

5.2 煌綠乳糖膽鹽( brilliant green lactose bile,BGLB)肉湯:見A.2。

5.3 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂( violet red bile agar,VRBA):見A.3。

5.4 無菌磷酸鹽緩沖液:見A.4。

5.5 無菌生理鹽水:見A.5。

5.6 1mol/ L NaOh溶液:見A.6。

5.7 1mol/LHCl溶液:見A.7。

**法大腸菌群MPN計數法

6.檢驗程序

大腸菌群MPN計數的檢驗程序見圖1。

7.操作步驟

7.1 樣品的稀釋

7.1.1 固體和半固體樣品:稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內,8000r/min~10000r/min均質lmin~2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1min~2min,制成1:10的樣品勻液。

7.1.2 液體樣品:以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)或其他無菌容器中充分振搖或置于機械振蕩器中振搖,充分混勻,制成1:10的樣品勻液。

7.1.3 樣品勻液的pH應在6.5~7.5之間,必要時分別用1mol/ L Nah或1mol/LHCl調節。

7.1.4 用ⅠmL無菌吸管或微量移液器吸?、?10樣品勻液lmL,沿管壁緩緩注9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭**不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復吹打,使其混合均勻,制成1:100的樣品勻液。

7.1.5 根據對樣品污染狀況的估計,按上述操作,依次制成十倍遞増系列稀釋樣品勺液。每遞増稀釋1次,換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢,全過程不得超過15min。

7.2 初發酵試驗

每個樣品,選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯,每管接種ⅠmL(如接種量超過ⅠmL,則用雙料LST肉湯),36℃士1℃培養24h土2h,觀察倒管內是否有氣泡產生,24h±2h產氣者進行復發酵試驗(證實試驗),如未產氣則繼續培養至48h士2h,產氣者進行復發酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。

7.3 復發酵試驗(證實試驗)

用接種環從產氣的LST肉湯管中分別取培養物Ⅰ環,移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)管中36℃±1℃培養48h±2h,觀察產氣情況。產氣者,計為大腸菌群陽性管。

7.4 大腸菌群*可能數(MPN)的報告

按7.3確證的大腸菌群BGLB陽性管數,檢索MPN表(見附錄B),報告每g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值。

第二法大腸菌群平板計數法

8.檢驗程序

大腸菌群平板計數法的檢驗程序見圖2。

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下載地址：《GB 4789.3-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》