初始污染菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證的目的是確保初始污染菌檢驗(yàn)方法的適用性，從而保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。初始污染菌的數(shù)量可以反映出車間環(huán)境衛(wèi)生的清潔度，與產(chǎn)品滅菌工藝、成品熱原及內(nèi)毒素有直接關(guān)系，故而要對(duì)其檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)其有效性及檢測(cè)準(zhǔn)確性，從而優(yōu)化產(chǎn)品滅菌工藝及控制產(chǎn)品熱原及內(nèi)毒素，確保產(chǎn)品的安全性。

初始污染菌也稱初始生物負(fù)載（bioburden）指產(chǎn)品或無(wú)菌屏障系統(tǒng)表面或內(nèi)部的活微生物數(shù)量。不同國(guó)家對(duì)不同產(chǎn)品的生物負(fù)載有不同的要求。

初始污染菌檢查時(shí)培養(yǎng)基的選擇，醫(yī)療器械產(chǎn)品初始污染菌中培養(yǎng)基適用性檢查菌種傳代數(shù)不要超過(guò)5代，菌種種類目前主要有5種：

大腸埃希菌 ?CMCC(B) 44 102

金黃色葡萄球菌 CMCC(B) 26 003

枯草芽孢桿菌 CMCC(B) 63 501

白色念珠菌CMCC(F) 98 001

黑曲霉菌 CMCC(F) ?98 003

獲取菌種的方法：可從藥檢所采購(gòu)自行培養(yǎng)稀釋，它的缺點(diǎn)是操作繁瑣，工作量大，菌數(shù)不準(zhǔn)確。所以目前大多數(shù)企業(yè)都會(huì)選擇商業(yè)化的培養(yǎng)基靈敏度指示劑，優(yōu)點(diǎn)是方便，可以在5min之內(nèi)完成操作，并且菌數(shù)準(zhǔn)確。主要步驟是將指示劑進(jìn)行溶解混勻，取100ul接種，然后培養(yǎng)，所以說(shuō)操作簡(jiǎn)便，菌量準(zhǔn)確。

接種數(shù)量50-100CFU，不同的培養(yǎng)基接種的微生物種類不同而有所不同。供試品對(duì)照組制備：取制備好的供試液100ml， 以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。

陰性對(duì)照組為確認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求所進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。如陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。

樣品份額（SIP)，當(dāng)整個(gè)樣品不可能全部用于無(wú)菌檢查時(shí)，可用樣品的其中一部分用于無(wú)菌檢查。

若不知道產(chǎn)品在微生物的分布，根據(jù)材料組成的比例來(lái)隨機(jī)選擇SIP。

若知道產(chǎn)品上的微生物是均勻分布的，則SIP可以從產(chǎn)品的任意部分選擇。

若知道產(chǎn)品上的微生物分布但分布又不均勻，則SIP可以選擇滅菌過(guò)程中*難滅菌的部位，或根據(jù)材料組成的比例來(lái)隨機(jī)選擇SIP。應(yīng)盡力盡快將試驗(yàn)樣品移至實(shí)驗(yàn)室。如果必須推遲轉(zhuǎn)送，在試驗(yàn)樣品的保存條件應(yīng)能避免微生物的丟失或改變。應(yīng)規(guī)定貯存*長(zhǎng)時(shí)間。干燥能成為微生物數(shù)量明顯減少的原因，所以在選擇貯存條件和貯存時(shí)間時(shí)應(yīng)加以考慮。

計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用平皿法或薄膜過(guò)濾法時(shí)，分為四個(gè)組，試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組、洗脫液對(duì)照組。

驗(yàn)證試驗(yàn)應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌的每次試驗(yàn)回收率。試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2 范圍內(nèi)。陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。

測(cè)定值

修正系數(shù)驗(yàn)證，修正系數(shù)、回收率用于補(bǔ)償無(wú)法從產(chǎn)品或培養(yǎng)基中完全去除微生物的數(shù)值。對(duì)某一特定的技術(shù)從產(chǎn)品上移除或培養(yǎng)微生物的能力的測(cè)定值。

修正系數(shù)=1/回收率。

回收率=（洗脫一次得到的微生物數(shù)量/ 接種的微生物數(shù)量）×****

回收率=（洗脫一次得到的微生物數(shù)量/ 洗脫N得到的微生物總數(shù)）×****

方法的回收率≥ 50%（0.5），藥典要求≥70%，應(yīng)評(píng)估產(chǎn)品理化特性、物理的處理方法對(duì)微生物的影響，在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，回收率均應(yīng)大于70%，則證明方法有效，若發(fā)現(xiàn)回收率低于70%，則應(yīng)排除干擾，重新驗(yàn)證，或選擇回收率接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)。

浸提液：0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，取至少三個(gè)樣品，向單個(gè)樣品中加入適量浸提液，充分震搖后收集于已滅菌容器中，即得**次洗脫液。同法洗脫第二次、第三次、第四次。

采用開(kāi)放式薄膜過(guò)濾法，每張濾膜過(guò)濾適量供試液，用適量浸提介質(zhì)沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于培養(yǎng)基上，每個(gè)樣品分別接種于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基各1個(gè)。另取浸提介100mL 同法操作，作為陰性對(duì)照。以上兩種培養(yǎng)基分別于 35℃和 25℃培養(yǎng)培養(yǎng)5天。

在計(jì)數(shù)時(shí)，分離到以前未遇到過(guò)的微生物，則應(yīng)對(duì)其特征進(jìn)行研究，并對(duì)其在生產(chǎn)過(guò)程，包括滅菌過(guò)程的潛在影響加以考慮和記錄存檔。

初始污染菌計(jì)數(shù)結(jié)果應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限值。應(yīng)采用用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的一些結(jié)果，如minitab、JMP，其優(yōu)點(diǎn)為可以發(fā)現(xiàn)被隨機(jī)誤差和已知的周期性波動(dòng)，如季節(jié)變換所掩蓋的一個(gè)細(xì)菌污染逐級(jí)向上的趨勢(shì)。通常微生物的數(shù)值在一段時(shí)間都保持在一個(gè)穩(wěn)定的水平，然后很短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)一個(gè)明顯的尖峰。這個(gè)尖峰的出現(xiàn)頻率應(yīng)該被重點(diǎn)監(jiān)測(cè)，看其頻率的變化情況以及是否符合影響初始污染。

偏差與變更控制，在確認(rèn)過(guò)程中如有不符合法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)或檢驗(yàn)的情況發(fā)生，實(shí)驗(yàn)員應(yīng)分析原因，找出原因，進(jìn)行糾正或改進(jìn)以達(dá)到要求，否則方法不能投入使用。驗(yàn)證執(zhí)行中若有對(duì)已批準(zhǔn)既定方案等變更，以及驗(yàn)證結(jié)束后決定對(duì)驗(yàn)證對(duì)象進(jìn)行必要變更的，必須報(bào)上級(jí)領(lǐng)導(dǎo)。必要時(shí)對(duì)可能影響產(chǎn)品質(zhì)量、安全性或有效性的主要變更進(jìn)行評(píng)估，確定是否需要變更后重新驗(yàn)證。

參考資料：

《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》

GB/T 19973.1-2015《醫(yī)療器械的滅菌微生物學(xué)方法 第 1 部分：產(chǎn)品上微生物總數(shù)的測(cè)定》

《中國(guó)藥典》2020 年版四部 1105 非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法

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