??殺菌劑的抗性現狀、抗性類型和抗性機制

??1.苯基酰胺類殺菌劑

??（1）抗性現狀

??苯基酰胺類殺菌劑主要包括甲霜靈、苯霜靈和惡霜靈，其中甲霜靈應用*為頻繁和普遍，抗藥性的研究與監測也*為深入透徹。甲霜靈*早于152 0173 3840年被引入作為系統殺菌劑防治卵菌病害，被廣泛用于防治致病疫霉和霜霉所引起的病害。1978年以色列用該藥防治黃瓜霜霉病，一年后，經檢測病菌對甲霜靈的抗藥性水平高達500倍以上。Sun等采用傳統葉盤法檢測了2007-2008年間我國7省11個地區葡萄霜霉病菌對甲霜靈的抗藥性，結果顯示，392菌株中有13%為敏感菌株，26%表現為低抗，61%為高抗，可見國內葡萄霜霉菌對甲霜靈已普遍產生抗藥性。

??（2）抗性類型和抗性機制

??該類殺菌劑的主要作用方式是抑制蛋白質及RNA的生物合成，特異性地抑制核糖體RNA聚合酶Ⅰ的活性，對植物病害的各主要生長階段如菌絲生長、吸器形成及孢子囊產生均具有很好的抑制作用。

??大量的研究表明，卵菌對甲霜靈的抗藥性是由單個主效基因控制的質量遺傳性狀，但病菌基因組中的抗性相關基因和抗性突變位點目前還尚不明確。2014年Randall等報道，甲霜靈的抗性與編碼RNA聚合酶Ⅰ大亞基RPA190基因單核苷酸多態性SNP T114**位點的突變相關，T和A分別代表敏感和抗性兩種類型，當該位點的堿基T突變為A時會造成絡氨酸被苯丙氨酸替代，*終導致RPA190等位基因由抗藥型變為敏感型。2015年Michael通過DNA測序、SNP和高分辨率溶解曲線（HRM）試驗證明，RPA190等位基因的SNP T114**位點的變化與甲霜靈抗藥性的變化不一致，指出用RPA190基因的變化不能夠充分診斷田間菌株對甲霜靈的敏感性水平。

??2.甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑

??（1）抗性現狀

??甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是一類能有效控制子囊菌、擔子菌、半知菌和卵菌為害的廣譜性殺菌劑。其代表藥劑為嘧菌酯，主要作用是抑制孢子萌發，游動孢子的釋放和游動，對病害無治療作用。該類藥劑于1996年進入市場用于防治小麥白粉病，兩年后在德國北部3個地區首次發現了抗QoI類殺菌劑的抗性菌株，抗性倍數大于500，抗藥性菌株在群體中的頻率高達90%。張艷菊等測定了我國8個省份13個黃瓜主產區霜霉菌對嘧菌酯的抗藥性，結果顯示無高抗菌株的存在，其中山東省菌株對嘧菌酯的抗性水平*高，其他省份抗性水平相對較低。

??（2）抗性類型和抗性機制

??嘧菌酯是一種高選擇性單一位點抑制劑，其通過與線粒體呼吸鏈中細胞色素bc1復合物中的Qo位點結合，從而達到阻礙電子傳遞，影響線粒體的呼吸作用。大量的試驗表明，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的抗藥性屬于質量遺傳抗藥性，在大多數病原菌中，細胞色素b基因中存在兩種主要的突變導致產生抗藥性，分別為143位甘氨酸被丙氨酸替代和129位苯丙氨酸被亮氨酸替代（G143A、F129L），143位甘氨酸被丙氨酸替代這種情況*為普遍。在對細胞色素b基因143位氨基酸突變的研究中發現，從遺傳學角度看存在4種主要的單倍型差異，這表明葡萄霜霉菌群體抗性至少存在兩種不同的起源。在法國霜霉菌抗藥性檢測中單倍型I（IS、IR）和單倍型II（IIS、IIR）的抗性頻率分別達到了75%和25%，并且這種分布差異很大。

??3.羧酸酰胺類殺菌劑

??（1）抗性現狀

??羧酸酰胺類殺菌劑是生產上用于替代苯基酰胺類殺菌劑，為緩解甲霜靈藥劑的抗藥性而研發的一類結構新穎的藥劑。烯酰嗎啉是該類藥劑中*早研發成功的一種，20世紀80年代由美國氰氨公司研發并投入市場，對霜霉病和晚疫病有特效。1994年，Albert等報道在法國地區出現了對該藥劑敏感性降低的葡萄霜霉病菌群體。2005年，在法國的東西南部等多個地區相繼監測到對烯酰嗎啉敏感性下降的病菌，但抗藥性頻率都較低，并且抗性群體的比例隨地區和年份的不同波動很大。在中國，2010年Sun等對采自全國7省11個地區采集的葡萄霜霉菌進行烯酰嗎啉敏感性測定，未發現抗性菌株。王喜娜等報道在2015年廣西資源縣的葡萄霜霉病菌株中發現了對烯酰嗎啉具有抗藥性的菌株，這是國內首次關于葡萄霜霉病菌對烯酰嗎啉具有抗性的報道。

??（2）抗性類型和抗性機制

??該類殺菌劑能夠抑制病原菌的菌絲生長、孢子囊及休止孢的萌發、卵孢子或孢子囊的形成，但是對游動孢子的游動、釋放以及休止孢的形成無抑制作用。烯酰嗎啉為該類殺菌劑的代表，其作用機制是破壞病菌細胞壁膜的形成，引起孢子囊壁的分解，而使病菌死亡。

??生物學試驗研究表明病原菌對烯酰嗎啉的抗藥性主要與纖維素合酶基因1105位點堿基突變有關，大量的試驗表明，病菌自然狀態下纖維素合酶PcCesA3基因在1105位的密碼子為GGC，編碼甘氨酸（GLy），在接觸大量的烯酰嗎啉藥劑后，該位點已發生堿基突變，由原來的GGC突變為AGC編碼絲氨酸（Ser）或者突變為GTC編碼纈氨酸（Val）。并且發現在所有對烯酰嗎啉敏感的菌株中，在1105位點編碼的氨基酸為GLy/GLy，GLy/Val，GLy/Ser，而在抗烯酰嗎啉的菌株中，在病菌的纖維素合酶PcCesA3基因的1105位點編碼的氨基酸為Ser/Ser，Val/Val，Ser/Val。即只有病菌在該位點發生純合突變，病菌才會由原來的對烯酰嗎啉敏感轉變為抗性，雜合突變只是抗性攜帶者并不表現為抗性。

??4.氰基乙酰胺類殺菌劑

??（1）抗性現狀

??霜脲氰，是20世紀70年代末被研發并廣泛應用于葡萄園內的一類系統防治卵菌病害的殺菌劑。霜脲氰對霜霉病和晚疫病有特效，有相當長一段時間，霜脲氰被為是一類具有低風險抗性的殺菌劑。然而，自20世紀90年代起，抗性菌株在意大利北部的兩個葡萄園中被檢測到。Sujkowski 等測定了來自墨西哥中部和北部的75個在遺傳上具有多樣性的致病疫霉菌株對霜脲氰的敏感性，結果表明各菌株對霜脲氰均表現敏感，且菌株間差異很小。霜脲氰自20世紀90年代初開始在中國大量使用，大部分地區的用藥歷史在10年以上。羅赫榮等用亞硝基胍誘變辣椒疫霉（P. capsici）的游動孢子，篩選出29株抗甲霜靈、6株抗霜脲氰的突變菌株，并證明突變菌株的抗藥性經無性和有性生殖均可穩定遺傳。生產上，霜脲氰主要是同其他殺菌劑一起混合使用，很少單一使用，這在一定程度上降低了病原菌對其產生抗藥性的機率。

??（2）抗性類型和抗性機制

??霜脲氰對病菌的各個生命活動進程均有影響，孢子囊萌發以及游動孢子釋放游動等一系列生物學試驗證明，霜脲氰在核酸和氨基酸的生物合成等一些二級反應過程發揮重要作用。另一方面霜脲氰對DNA合成過程的影響明顯大于RNA合成的影響，但主要的作用位點、作用機制目前仍是未解之謎。

??5. 磺胺咪唑類殺菌劑

??（1）抗性現狀

??該代表藥劑為氰霜唑，作為對卵菌綱病害有特效的一款藥劑，氰霜唑對霜霉病、疫病有良好的效果，并且與市場上的苯酰胺類、羧酸酰胺類殺菌劑無交互抗性。目前，國內外對氰霜唑抗藥性的研究相對較少。2012年，Jackson等通過對美國喬治亞州辣椒疫霉對氰霜唑、雙炔酰菌胺和烯酰嗎啉三種藥劑的混劑的抗藥性進行檢測，在三種藥劑單獨使用的情況下，通過菌絲生長、孢子萌發等方法檢測菌株抗藥性，結果發現菌株對雙炔酰菌胺和烯酰嗎啉均較敏感，而對氰霜唑已產生一定程度的抗藥性，菌絲生長法和孢子萌發法測定結果顯示其*小抑制濃度（MIC）已達500 μg/mL，但混合物對孢子的萌發有很高的抑制作用，其平均 EC50 值僅為 0.04 μg/mL，可見氰霜唑單獨使用抗藥性風險較高。

??（2）抗性類型和抗性機制

??氰霜唑是一種保護性殺菌劑，通過結合細胞色素bcl復合體中的Qi位點阻斷卵菌線粒體細胞色素 bcl 絡合物中的電子傳遞來干擾能量供應。它的作用部位是在酶的Qi中心，這種作用機制不同于其他傳統殺菌劑，包括甲氧基丙烯酸酯類。氰霜唑通過干擾能量供應可以阻礙游動孢子萌發、游動至孢子囊形成的各個生育階段，從而達到預防和控制病害蔓延的目的。對霜霉病、晚疫病和十字花科根腫病有特效。通過在試驗中額外添加ATP，降低氰霜唑的藥效，表明氰霜唑的作用方式與ATP能量供應系統緊密相連。

??抗藥性檢測方法

??1.傳統檢測方法

??葡萄霜霉病對殺菌劑的抗藥性檢測方法通常采用傳統葉盤漂浮法，以鮮嫩易感病的葡萄葉片作為試驗材料，一般為‘里扎馬特’’赤霞珠‘’玫瑰香‘等易感品種，先用1%的次氯酸鈉溶液進行消毒，30 s 后用去離子水清洗，然后在超凈工作臺中用打孔器打成15 mm葉盤，試驗過程中將葉盤漂浮在裝有藥液的9 cm培養皿中，每皿10個葉盤，對照組采用無菌水代替藥液，根據發病情況判斷抗藥性情況。

??甲霜靈目前主要采用此方法進行抗藥性檢測，其普遍使用的標準為敏感檢測濃度MIC（0.1 μg/mL）作為敏感參考標準用于判斷其他試驗的敏感性情況，根據Stahle-Csech的抗性因子檢測標準，RF > 100即表示產生了抗性，定義當MIC=1 μg/mL，RF = 10時為敏感菌株；當MIC = 10 μg/mL，RF = 100時為低抗；當MIC = 100 μg/mL，RF = 1000時為抗性；當MIC ≥ 200 μg/mL，RF ≥ 200時為高抗。在葡萄霜霉菌對甲霜靈的抗藥性試驗研究中采用兩個明顯的檢測濃度標準， MIC為10 μg/mL和100 μg/mL，即菌株在空白對照組中發病且在10 μg/mL藥液濃度下未發病，定義為敏感菌株；在10 μg/mL藥液濃度下發病但在100 μg/mL藥劑濃度下未發病的菌株定義為低抗菌株；在100 μg/mL藥劑濃度下發病的菌株定義為高抗。這套檢測體系一直作為檢測甲霜靈抗藥性的標準體系沿用至今。

??嘧菌酯抗藥性檢測目前有兩種主要的方法，傳統葉盤漂浮法和分子檢測技術，在傳統檢測方法中，根據Wong等的報道，葡萄霜霉菌對嘧菌酯藥劑的EC50值范圍為0.04～0.94 μg/mL，平均EC50 值為0.40 μg/mL。傳統葉盤法進行霜霉菌對嘧菌酯抗性檢測所用的鑒別濃度為1000 μg/mL，定義菌株在1000 μg/mL藥液濃度下發病即產生了抗藥性。

??烯酰嗎啉，目前有兩種主要的抗藥性檢測方法，傳統葉盤漂浮法和分子檢測技術。據Sun等的報道，葡萄霜霉菌對烯酰嗎啉的EC50值范圍為0.01 μg/mL到0.21 μg/mL，平均EC50值為0.11 μg/mL，傳統葉盤法進行葡萄霜霉菌對烯酰嗎啉抗性檢測標準濃度為1.6 μg/mL，MIC > 1.6 μg/mL即為抗性個體，MIC < 1.6 μg/mL為敏感個體。

??霜脲氰，目前沒有明確統一的檢測標準，其作用的方式也尚未知曉，研究中一般主要采用傳統的葉盤漂浮法進行抗藥性初步判定。在已報道的文獻中將參考菌株的MIC值3 μg/mL作為標準參考基線，以此為標準測定試驗菌株的抗性因子，抗性因子大于等于10（RF≥10）即表示產生了抗性；田間用藥的標準參考基線為120 μg/mL，可用此標準進行田間或者栽培植株整體抗藥性試驗。

??氰霜唑，一般作為混劑使用，國內外研究報道都較少，抗藥性檢測所使用的方法也只有傳統的檢測方法。2001年，有研究報道通過菌絲生長法測定疫霉菌對氰霜唑的EC50值為0.008～0.2 μg/mL，對游動孢子釋放的MIC為0.1 μg/mL。2012年的研究報道，氰霜唑對辣椒炭疽病菌的菌絲生長MIC值達到500 μg/mL，但游動孢子囊萌發試驗顯示其EC50值為0.007～0.008 μg/mL。關于葡萄霜霉病對氰霜唑的抗藥性相關研究還較少，其抗藥性檢測標準，MIC以及EC50值等目前尚未明確，有待進一步探索。

??這些傳統的檢測方法存在周期長、效率低、工作量大且穩定性差等缺點。由于葡萄霜霉菌為專性寄生菌，培養條件較為嚴苛且培養周期較長，因此采用傳統方法檢測其抗藥性不僅耗費時間而且其結果受培養條件和藥劑的質量影響較大。隨著殺菌劑的作用方式和抗性機理不斷被揭示，根據殺菌劑的抗性機制，越來越多的分子檢測技術被相繼開發應用，傳統的檢測方法也逐漸被現代的分子檢測技術替代。

??2.分子檢測技術

??隨著現代分子生物學技術的不斷發展，殺菌劑的作用機理以及病原菌的抗性機制相繼被揭示，核酸水平的分子檢測技術已成功應用于已明確抗藥性突變位點的病原菌田間早期的抗性菌株的快速、準確檢測以及監測抗藥性群體的發展動態等。應用此方法的一個重要前提是殺菌劑的機制以及病原菌的抗藥性突變位點必須明確清晰，因此，目前該技術還處于初步發展階段，許多殺菌劑的機理以及對應的病原菌抗藥性突變機制還尚不清晰。

??目前，用于檢測殺菌劑抗性的分子技術層出不窮，如突變阻滯擴增系統（ARMS）、PCR-RFLP和nested PCR-RFLP技術、高分辨率溶解曲線（HRM）、環介導恒溫擴增法（LAMP）、Tetra-primers ARMS PCR以及Taqman-MGB探針實時熒光PCR檢測技術等。Aoki等根據葡萄霜霉菌對羧酸酰胺類殺菌劑產生抗性后的單核苷酸點突變這一原理，開發了PCR-RFLP抗藥性分子檢測技術，顯著提高了檢測效率。Zhang等基于葡萄霜霉菌對烯酰嗎啉抗性突變位點，建立了Tetra-primers ARMS PCR檢測方法。Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測技術是一項靈敏度高、特異性強的分子檢測技術，MGB分子的存在使得Taqman探針與互補的DNA 鏈結合更為特異。因此，探針可以識別出DNA鏈中的單個堿基變化。郭慶等利用Taqman-MGB探針實時熒光PCR檢測技術對葡萄根瘤蚜進行檢測，證明了該方法的特異性，靈敏度可達1.625拷貝/μL。金麗蘭等利用該技術分析了YP3A5基因rs776746位點單核苷酸多態性，結果發現該技術對于CYP3A5 rs776746位點基因型的區分效率*高，*低檢測含量僅為0.01 ng，具有較好的特異性和靈敏度。這些方法各有優勢與缺點，因根據自身研究的目的合理選擇相應的方法。

??展望

??目前，生產上用于防治卵菌的五大類主要內吸性殺菌劑中，只有羧酸酰胺類殺菌劑中的烯酰嗎啉和嘧菌酯的病原菌抗性機制和抗藥性突變位點已經明確。常用的檢測這兩種藥劑抗藥性的方法主要為 PCR-RFLP和Nested PCR-RFLP技術、Tetra-primers ARMS PCR以及Taqman-MGB探針實時熒光PCR檢測技術。對于甲霜靈、霜脲氰和氰霜唑這三種藥劑其病原菌抗性機制還在研究探索中。目前，代謝組學相關技術已經應用于甲霜靈抗藥性的檢測，通過測定甲霜靈用藥前后病原菌體內各組分的代謝變化來辨別抗性菌株和敏感菌株。作者： 張昊 ? 周連柱 ? 孔繁芳